南方鲇愛德華氏菌的分離鑒定及雙重PCR診斷方法的建立.pdf

1、本研究采集發(fā)病南方鲇進(jìn)行了遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的分離鑒定，并對(duì)遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的雙重PCR診斷方法進(jìn)行構(gòu)建。
　　從樂山南方鲇養(yǎng)殖場(chǎng)采集自然發(fā)病南方鲇，無菌操作從病魚肝、腎分離優(yōu)勢(shì)菌，結(jié)果從自然發(fā)病魚肝、腎中分離到兩株優(yōu)勢(shì)菌（CH0406和H0701）。人工感染試驗(yàn)確定其病原性，人工感染試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)兩分離株為南方鲇的致病菌，人工感染魚出現(xiàn)與自然感染相似的臨床癥狀與病變;對(duì)分離菌株進(jìn)行各項(xiàng)理化性質(zhì)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，分離株

2、CH0406在LB平板上28℃培養(yǎng)24h就能長(zhǎng)出形成邊緣整齊，灰白色，直徑為0.5-1mm的圓形菌落，H0701在BHI培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48h形成直徑0.2-0.3mm針尖大小，表面光滑，邊緣整齊，無色透明的圓形菌落的菌落;分離株CH0406和H0701生化特性分別與E.tarda標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC15947)和E.ictaluri標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC33202)一致;采用細(xì)菌16S rDNA保守區(qū)通用引物(F:5'-AGAGTTTGA

3、TCCTGGCTCAG-3',R:5'-TACGGCTACCT TGTTACGAC-3')進(jìn)行基因擴(kuò)增，擴(kuò)增出預(yù)期大小的約1500bp的目的片段，序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析表明，2分離株分別與GenBank中E.tarda和E.ictaluri16S rDNA序列同源性均達(dá)99％以上;在基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，CH0406與E.tarda聚為一族，而H0701與E.ictaluri聚為一族;根據(jù)E.tarda的gadB基

4、因和E.ictaluri的eip基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物(gadB:F:5'-ATTTGGATTCCCGCTTTGGTTCA-3',R:5'-GCACGACGCCGATGGTGTTCTC-3';eip:F:5'-TCATCACATCATCTAGCGATT-3'，R:5'-CTTTACACAGATAGGCGATAC-3')，進(jìn)一步鑒定分離病原菌，預(yù)計(jì)擴(kuò)增出的特異性核酸片段大小分別為582bp和276bp，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時(shí)分別基于遲緩愛德華氏

5、菌gadB基因和鮰愛德華氏菌eip基因進(jìn)行的特異性PCR檢測(cè)中，兩分離菌均為陽性，根據(jù)以上結(jié)果將CH0406鑒定為E.tarda，將H0701鑒定為E.ictaluri。
　　利用兩對(duì)特異性引物對(duì)樣品中遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，優(yōu)化反應(yīng)條件，并對(duì)雙重PCR方法的特異性和敏感性進(jìn)行分析。優(yōu)化后雙重PCR反應(yīng)體系為:25uL體系:10×PCR Buffer2.5μL，10 mmol/L dNTPs1.0μL，Ta

6、q DNA polymerase0.5μL，Mg2+濃度的范圍是1mmol/L至2.5mmol/L，E.tarda和E.ictaluri的上下游引物都各加0.7μmol/L，兩種模板DNA質(zhì)量濃度都為2.0 ng/μL，加雙蒸水至25μL; PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變5min，94℃變性1min，58℃退火1 min，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min: PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳可檢測(cè)到大小分別為582bp