兔須癬毛癬菌的鑒定及快速診斷方法的建立.pdf

1、兔皮膚真菌病是由皮膚癬菌引起的一類傳染性很強的接觸性傳染病。在世界范圍內(nèi)廣泛流行。兔須癬毛癬菌病不僅嚴(yán)重影響?zhàn)B兔業(yè)經(jīng)濟效益，還是人畜共患傳染病，引起人皮膚真菌病，嚴(yán)重危害養(yǎng)殖生產(chǎn)者及公眾健康。因此，對須癬毛癬菌進行準(zhǔn)確鑒定，并建立特異，敏感的，快速的診斷方法，篩選出有效的抗真菌藥物，對于養(yǎng)殖生產(chǎn)及公眾健康具有重要意義。
　　采用rDNA-ITS序列分析結(jié)合真菌形態(tài)學(xué)和生理學(xué)試驗對兔須癬毛癬菌進行鑒定。從疑似患兔采集皮屑樣品接種沙保

2、弱培養(yǎng)基，觀察菌落特征及菌絲顯微結(jié)構(gòu)，并進行尿素酶和毛發(fā)穿孔試驗。提取分離株（29株）DNA，利用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物測序后在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，結(jié)果顯示，分離株的菌落形態(tài)為白色粉末狀，背面有色素沉著，培養(yǎng)可見大量葡萄狀小分生孢子，螺旋菌絲及棒狀大分生孢子；尿素酶和毛發(fā)穿孔試驗陽性；rDNA-ITS序列比對結(jié)果顯示，分離株與須癬毛癬菌復(fù)合體中的萬博節(jié)皮菌同源性在99.2％以上；從形態(tài)學(xué)和生

3、理學(xué)試驗符合須癬毛癬菌的特點，結(jié)合分子生物學(xué)試驗將29株分離株鑒定為萬博節(jié)皮菌。
　　利用幾丁質(zhì)酶基因（CHS1）序列分析結(jié)合菌落特征對兔須癬毛癬菌分離株（31株）進行分型。結(jié)果顯示菌落特征分為顆粒型、粉末型和絨毛型3種表型，其中多數(shù)為顆粒型和粉末型，占87.09%(27/31)，基于CHS1序列同源性差異，分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ5種基因類型，其中Ⅰ型和Ⅱ型是優(yōu)勢菌株，占54.84%(17/31)，這些提示CHS1序列分析可以用于

4、須癬毛癬菌的基因分型。
　　采用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法對兔須癬毛癬菌進行定量檢測。結(jié)果表明,利用此方法可以檢測病原菌DNA的最低稀釋度為10-10,而常規(guī)PCR檢測病原菌DNA最低稀釋度為10-8。并且,特異性強，與犬小孢子菌、絮狀表皮癬、紅毛癬菌、白色念珠菌、煙曲霉等病原真菌沒有交叉反應(yīng)；對于須癬毛癬菌分離株陽性檢出率為100%（10/10），臨床分離須癬毛癬菌陽性檢出率為86%（54/63）。證明采用熒光定量

5、PCR方法對須癬毛癬菌進行快速診斷具有良好的可行性。
　　對31株須癬毛癬菌對藥物的敏感性進行了研究。我們采用了11種常用抗真菌藥物利用紙片擴散法進行了藥敏試驗,結(jié)果表明:特比萘芬、克霉唑、伏立康唑?qū)毎_毛癬菌的抑制作用最強,31株菌對這三種藥物敏感率為100%，抗菌效果最好；其次為伊曲康唑、酮康唑、益康唑、兩性霉素-B、制霉菌素、咪康唑，31株菌對這幾種藥物的敏感率分別為93.55%、90.32%、83.87%、48.39%、3