抗腫瘤天然產(chǎn)物CC-1065和YM-216391生物合成相關(guān)基因功能研究.pdf

1、CC-1065是1978年由美國(guó)Upjohn公司發(fā)現(xiàn)的，它是由鏈霉菌Streptomyces ZelensvsNRRL11183發(fā)酵培養(yǎng)基中分離出的一類具有抗真菌和高抗腫瘤活性的的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物。它與已發(fā)現(xiàn)的Yatakemycin，DuocarmycinA，DuocarmycinSA等屬于同一家族，這類家族的骨架部分是由吲哚與兩個(gè)吡咯吲哚環(huán)通過兩個(gè)酰胺鍵連接組成。CC-1065分子中藥效基團(tuán)---環(huán)丙烷苯并二吡咯亞基對(duì)細(xì)胞的有絲分裂

2、期G2期和M期起作用，其作用機(jī)制是直接與DNA共價(jià)結(jié)合，形成更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，這樣穩(wěn)定的DNA結(jié)構(gòu)很難被解旋，從而難以復(fù)制DNA，起到強(qiáng)大的抑制腫瘤細(xì)胞繁殖的能力。
　　 雖然CC-1065有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，但是其水溶性較差，對(duì)肝腎也有比較大的毒性，在臨床應(yīng)用受到了限制，所以我們希望了解其生物合成機(jī)制來進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，從而研制出毒性較小，藥性更強(qiáng)的新型化合物。
　　 在本課題組蹇曉紅博士克隆得到的完整的CC-1065基因簇

3、的基礎(chǔ)上，對(duì)基因簇進(jìn)行詳細(xì)的序列分析，整個(gè)基因簇共包含38.626kb，29個(gè)ORF。另外我們推測(cè)每個(gè)基因最有可能的功能及其在CC-1065生物合成中所起的作用，進(jìn)而對(duì)CC-1065的生物合成機(jī)制提出合理假設(shè)。
　　 本工作主要研究重點(diǎn)是CC-1065基因簇中的10個(gè)基因的功能分析。通過基因敲除，我們發(fā)現(xiàn)其中c10V，c10K,c10E,c10S,c100這5基因突變株發(fā)酵產(chǎn)物HPLC檢測(cè)顯示中斷了CC-1065的產(chǎn)生，c10W

4、，c10D,c10R6這3個(gè)基因突變株的發(fā)酵結(jié)果顯示未中斷CC-1065的產(chǎn)生。還有在抗性基因c10R5的敲除和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)缺失突變株ΔR5較野生型減少了17％，回補(bǔ)突變株ΔR5-回補(bǔ)較野生型增加了5％，我們推測(cè)這與抗性基因自我保護(hù)機(jī)制有關(guān)。另外在c10A敲除實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)有一個(gè)m/z=432(M+NH4)新化合物的積累，這個(gè)新化合物的分離鑒定將有可能揭示CC-1065部分生物合成機(jī)制。這些基因功能的初步研究為下一步揭示CC-10

5、65的生物合成途徑打下了基礎(chǔ)。同時(shí)為以后的相關(guān)酶催化研究創(chuàng)造了有力的開局。
　　 我們課題組另外對(duì)具有代表性的環(huán)肽YM-216391進(jìn)行了初步研究。環(huán)肽YM-216391是含多惡唑-噻唑環(huán)的大環(huán)天然產(chǎn)物，具有良好的抗腫瘤活性。此前實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克隆得到其生物合成基因簇，為了探討環(huán)肽YM-216391的異源合成，本研究將包含YM-216391合成整個(gè)基因簇的粘粒導(dǎo)入不同的鏈霉菌中，結(jié)果顯示，YM-216391在幾個(gè)不同的鏈霉菌宿主中都