新型抗腫瘤抗生素力達(dá)霉素生物合成調(diào)控基因sgcR和sgcM的功能研究.pdf

1、力達(dá)霉素(lidamycin)是一種新型的烯二炔類抗腫瘤抗生素，又叫C一1027，由球孢鏈霉菌C-1027(S.globisporus C-1027)產(chǎn)生。其分子由一個酸性輔基蛋白和一個烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)非共價結(jié)合組成。力達(dá)霉素生物合成基因簇已被克隆，其中一些結(jié)構(gòu)基因的功能已經(jīng)闡明，并由此推測了力達(dá)霉素的主要生物合成步驟。在力達(dá)霉素生物合成基因簇中有一些功能尚未明確的基因，通過生物信息學(xué)的分析推測其中某些基因可能為力達(dá)霉素生物合成中的調(diào)

2、控基因。其中，sgcR基因全長1，148 bp，位于力達(dá)霉素生物合成基因簇序列中54,226-55,374．bp。氨基酸序列比對分析表明，SgcR與一個屬于XRE(Xenobiotic Response Element．XRE)家族的DNA結(jié)合蛋白具有一定的相似性，XRE家族蛋白是一類具有典型HTH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白；sgcM基因全長1，040 bp，位于力達(dá)霉素生物合成基因簇序列中50,345-51，385 bp。氨基酸序列比對分析

3、表明，SgcM與Streptomycescarzinostaticus新制癌菌素生物合成基因簇ORF14編碼的蛋白高度同源。此外，SgcM還與s.coelicolorA3(2)中的一個DNA結(jié)合蛋白有一定同源性，該蛋白具有可以結(jié)合DNA的HTH基序。 為了研究sgcR和sgcM在體內(nèi)的生物學(xué)功能，本實驗采用同源重組雙交換的方法分別將sgcR和sgcM基因阻斷。在基因中斷實驗中，利用pKC1139和pOJ260載體分別構(gòu)建了兩種阻

4、斷質(zhì)粒。阻斷質(zhì)粒包含所要阻斷目的基因上游和下游兩側(cè)的約1 kb片段，并在兩片段中間插入硫鏈絲菌素抗性基因片段(捃r)作為篩選標(biāo)記。將重組質(zhì)粒通過接合轉(zhuǎn)移的方法從大腸桿菌E.coli ETl2567/pUZ8002轉(zhuǎn)移至S.globisporus C-1027。通過抗性篩選得到了具有硫鏈絲菌素抗性(Thid)而阿普霉素敏感(Am<'s>)的接合子，得到可能發(fā)生了同源雙交換的接合子。利用PCR和Southern Blot的方法對其進(jìn)行驗證，

5、最終獲得了發(fā)生同源雙交換的sgcR和sgcM阻斷突變株。sgcR突變株命名為S.globisporus RKO，在其基因組上，sgcR內(nèi)部大部分片段被tsr取代；sgcM突變株命名為S.globisporus MKO，在其基因組上，sgcM內(nèi)部大部分片段被tsr取代。 分別以pSET152和pKC1139作為回復(fù)載體，將帶有強(qiáng)啟動子ermE<'*>P的sgcR分別克隆至兩種載體的多克隆位點，導(dǎo)入阻斷株中進(jìn)行遺傳互補(bǔ)。經(jīng)過抗性篩選

6、以及驗證后得到sgcR的互補(bǔ)菌株。對阻斷和回復(fù)突變株進(jìn)行發(fā)酵后，取發(fā)酵液進(jìn)行生物檢定，結(jié)果顯示在阻斷突變株S.globisporus RKO中力達(dá)霉素產(chǎn)量提高，而互補(bǔ)菌株中力達(dá)霉素的產(chǎn)生與阻斷株相比明顯被抑制。根據(jù)以上結(jié)果推斷SgcR可能為力達(dá)霉素生物合成過程中的一個重要負(fù)調(diào)控因子。 分別以pSET152和pKC1139作為回復(fù)載體，將帶有強(qiáng)啟動子erm<'*>Ep的sgcM分別克隆至兩種載體的多克隆位點，導(dǎo)入阻斷株中進(jìn)行遺傳互