聚醚類抗生素鹽霉素的生物合成機制.pdf

1、鹽霉素(salinomycin)是由白色鏈霉菌產(chǎn)生的聚醚類抗生素,作為球蟲抑制藥和生長促進劑被廣泛地應用于畜牧業(yè)和家禽飼養(yǎng)業(yè)。最新研究發(fā)現(xiàn)鹽霉素能夠高效抑制上皮腫瘤肝細胞的生長。但是前期鹽霉素生物合成的研究僅停滯于同位素標記的前體的喂養(yǎng)實驗。通過大片段缺失實驗,我們發(fā)現(xiàn)之前文獻報道的4.5-kb鹽霉素基因簇序列與鹽霉素的生物合成并不相關(guān)。隨后,我們根據(jù)目前報道的聚醚類抗生素生物合成基因簇中的關(guān)鍵酶環(huán)氧化酶的高度保守性,基于CODEHOP

2、和PaBaliS原理首次設(shè)計并成功篩選到適于挖掘潛在的聚醚類抗生素基因簇的簡并性引物。利用這對簡并性引物,我們在白色鏈霉菌XM211的基因組中克隆到了可能與鹽霉素生物合成相關(guān)的環(huán)氧化酶基因slnC。通過分析slnC基因置換突變株JCY16及其回補株的發(fā)酵產(chǎn)物,我們確定 slnC是鹽霉素生物合成所必需的。最終,我們通過染色體步移獲得了127-kb的DNA區(qū)域,進一步序列測定和分析發(fā)現(xiàn)其中包括I型聚酮合酶基因、環(huán)氧化酶基因、環(huán)氧水解酶基因、

3、細胞色素P450單氧化酶基因以及調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運基因等。通過序列分析我們也推測了鹽霉素各聚酮合酶(SlnA1-A9)中的模塊和結(jié)構(gòu)域組成。由于模塊14和模塊6的結(jié)構(gòu)域組成中均缺少脫水酶(DH)結(jié)構(gòu)域,所以合成的鹽霉素聚酮鏈在C3及C19為羥基結(jié)構(gòu),而并不是預測的C2-C3位(與該位置四氫呋喃環(huán)形成相關(guān))和C18-C19位雙鍵。我們初步推測這兩步脫水反應是由獨立的脫水酶催化完成,但在克隆的127-kb序列中我們并未發(fā)現(xiàn)脫水酶基因。這兩個位置的雙

4、鍵形成原因成為一個令人困惑而又值得深究的問題。
　　鹽霉素生物合成基因簇的核心區(qū)域含有一個甲基轉(zhuǎn)移酶基因slnM,其編碼的蛋白與羧甲基轉(zhuǎn)移酶TcmP具有較高的同源性。但鹽霉素生物合成推測沒有任何甲基化反應且HPLC-MS檢測白色鏈霉菌XM211的發(fā)酵產(chǎn)物中并不含有鹽霉素甲基化衍生物。有趣的是,體內(nèi)失活和回補實驗表明slnM是鹽霉素生物合成的必需基因,且slnM突變株積累了一個新的化合物1。核磁共振譜顯示化合物1是鹽霉素的結(jié)構(gòu)類似物

5、,不同之處在于C19位為羥基,C17-C18為雙鍵結(jié)構(gòu),并且化合物1中三元螺環(huán)尚未形成,為二元螺環(huán)結(jié)構(gòu)。將化合物1喂養(yǎng)到喪失鹽霉素產(chǎn)生能力但含有完整的slnM基因的突變株中,發(fā)酵結(jié)果顯示部分化合物1被轉(zhuǎn)化為鹽霉素,說明1可能是鹽霉素生物合成的中間產(chǎn)物。在大腸桿菌中異源表達的SlnM能夠催化化合物1轉(zhuǎn)化為鹽霉素,表明SlnM催化了鹽霉素生物合成的最后一步反應,即負責C18-C19位雙鍵和三元螺環(huán)的同時形成。通過監(jiān)測 S-腺苷甲硫氨酸(SA

6、M)在反應體系中的濃度,我們發(fā)現(xiàn)SAM在反應中并不被消耗。進一步的實驗結(jié)果表明甲基化抑制劑sinefungin(SAM的結(jié)構(gòu)類似物)能夠替代SAM作為SlnM催化反應的輔因子。我們還發(fā)現(xiàn)化合物1中C1位羧基被甲酯化封閉后得到的化合物不能被SlnM催化利用。根據(jù)這些實驗結(jié)果,我們推斷了SlnM的反應機理,即 SAM或 sinefungin通過靜電作用使化合物1穩(wěn)定的處于類似于鹽霉素的構(gòu)型,有利于SlnM中的活性氨基酸催化C18-C19位雙

7、鍵的形成和三元螺環(huán)的形成,得到鹽霉素。SlnM的發(fā)現(xiàn)不但擴展了我們對SAM在生化反應中作用的認識,而且揭示了聚酮類化合物中雙鍵形成的一類新機制。
　　為了探索鹽霉素的生物合成機制,我們通過基因置換手段對基因簇中另外12個基因進行了失活。突變株發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)HPLC-MS檢測顯示,其中5個基因是鹽霉素生物合成的必需基因,可能參與鹽霉素聚酮鏈釋放(slnBI)、PKS后修飾(slnF)、環(huán)氧化水解(slnBII、slnBIII)以及正調(diào)控

8、(slnR)等;另外5個基因與鹽霉素的生物合成相關(guān)但并非必需基因,可能與四碳前體的合成(orf11、orf12)、聚酮鏈延伸過程非正常底物的清除(slnDII)以及調(diào)控(orf15、orf16)等相關(guān)。與其它已報道的聚醚類抗生素基因簇不同,鹽霉素生物合成基因簇中包含三個環(huán)氧水解酶基因:slnBI、slnBII、slnBIII。slnBII和slnBIII突變株都喪失了鹽霉素產(chǎn)生能力,積累了兩個新的化合物A和B,暗示SlnBII和SlnB