芳香聚酮抗生素美達(dá)霉素生物合成基因的功能研究.pdf

1、聚酮抗生素美達(dá)霉素（medermycin）具有抗菌和抗腫瘤等生物學(xué)活性，其生物合成途徑還未闡明。本文利用生物信息學(xué)、遺傳學(xué)和分析化學(xué)等手段，就其生物合成基因簇中幾個(gè)相關(guān)基因展開功能分析，內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面： （1）新型C-糖基轉(zhuǎn)移酶基因：根據(jù)同源性分析，推斷基因med-ORF8可能負(fù)責(zé)催化美達(dá)霉素的C-C糖苷健的形成（Ichinose K.et al.，2003）。本研究首先使用目前較為常用的PCR介導(dǎo)的鏈霉菌基因突變系統(tǒng)（R

2、edirectTM）對(duì)med-ORF8進(jìn)行基因突變分析：完整的美達(dá)霉素生物合成基因簇導(dǎo)入一個(gè)特殊大腸桿菌細(xì)胞，在這個(gè)細(xì)胞內(nèi)，定點(diǎn)敲除美達(dá)霉素生物合成基因簇中的這個(gè)目的基因med-ORF8，獲得-個(gè)攜帶有美達(dá)霉素突變基因簇的質(zhì)粒（命名為pHSL3），將其導(dǎo)入一個(gè)常用鏈霉菌異源表達(dá)細(xì)胞（Streptomyces coelicolorCH999）中，并進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)物的提取和LC-MS分析。研究發(fā)現(xiàn)同野生完整的美達(dá)霉素基因簇相比，突變基因簇不能合

3、成美達(dá)霉素（初步推斷有脫糖基中間產(chǎn)物積累）；然后進(jìn)行目的基因的互補(bǔ)分析，即構(gòu)建了一個(gè)關(guān)于med-ORF8的鏈霉菌表達(dá)質(zhì)粒pHSL5，導(dǎo)入上面所獲得的突變基因簇表達(dá)體系中。對(duì)基因回補(bǔ)菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)med-ORF8的導(dǎo)入導(dǎo)致美達(dá)霉素又重新產(chǎn)生，說明在美達(dá)霉素生物合成途徑中，基因med-ORF8確實(shí)是個(gè)必需基因。 （2）糖基合成酶基因：在美達(dá)霉素生物合成基因簇中含有6個(gè)脫氧六碳糖基合成酶的同源基因，推測(cè)負(fù)責(zé)稀有的脫氧六碳

4、糖胺（安哥拉糖胺）的形成，前期工作中這6個(gè)可能參與糖基合成的基因和上面研究的med-ORF8已經(jīng)克隆在一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒上（pAYT55）。本研究利用這個(gè)多基因共表達(dá)體系來驗(yàn)證這些基因的功能，即將這個(gè)多基因共表達(dá)質(zhì)粒通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入一個(gè)能產(chǎn)生芳香聚酮kalafungin（推測(cè)與med-ORF8的糖基受體結(jié)構(gòu)相似）的鏈霉菌細(xì)胞（Streptomyces coelicolor B135）中，然后對(duì)這個(gè)體系的代謝產(chǎn)物進(jìn)行LC/MS分析。結(jié)果顯示

5、以上這7個(gè)基因的共表達(dá)質(zhì)粒在B135中可以導(dǎo)致美達(dá)霉素的積累，而僅含這6個(gè)糖基合成酶基因的共表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入B135中，則沒有檢測(cè)到美達(dá)霉素的產(chǎn)生。此結(jié)果說明在美達(dá)霉素生物合成途徑中，這6個(gè)基因與med-ORF8共同完成了糖基合成和糖基轉(zhuǎn)移的功能。 （3）新型轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因：根據(jù)同源性分析推斷在美達(dá)霉素生物合成基因簇中的med-ORF10為一個(gè)新型轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因（Taguchi T.et al.，2007）。前期工作中利用Redirec

6、TM系統(tǒng)已經(jīng)構(gòu)建好一個(gè)突變基因簇（即在完整美達(dá)霉素生物合成基因簇中定向敲除目的基因med-ORF10）。本研究將攜帶這個(gè)突變基因簇的質(zhì)粒pAYT64通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入鏈霉菌的異源表達(dá)宿主（Streptomyces coelicolor CH999）中。對(duì)獲得的菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS分析。結(jié)果顯示由于這個(gè)基因的敲除導(dǎo)致美達(dá)霉素產(chǎn)量急劇減少，同時(shí)有中間體積累，說明該基因在美達(dá)霉素生物合成中起到正向調(diào)控作用。 以上這些研究結(jié)果