粘細菌Stigmatella WXNXJ-B產(chǎn)生新型抗腫瘤抗生素的研究.pdf

1、粘細菌是一類具有群體習性和復雜發(fā)育史的、革蘭氏陰性單細胞的滑行細菌的總稱。粘細菌能產(chǎn)生很多具有生物活性的化合物,這些化合物具有結構新、種類多、作用機制多樣等特點,為新藥的篩選提供了很好的微生物資源,因此關于粘細菌生物活性物質的研究工作日趨受到重視。本文對本實驗室保存的WXNXJ-B菌株進行生理生化特征鑒定并分類;檢測其產(chǎn)生的揮發(fā)性物質,并對其生長條件進行了優(yōu)化;以小鼠黑色素瘤B16細胞為模型,對其產(chǎn)生的高活性代謝產(chǎn)物進行分離、純化和鑒定

2、;并以其為主要目標,對WXNXJ-B菌株搖瓶發(fā)酵條件進行了優(yōu)化;分析WXNXJ-B產(chǎn)生的活性物質對腫瘤細胞和正常細胞的毒性以及探索體外對腫瘤細胞的凋亡機理。
　　 對WXNXJ-B菌落形態(tài)和生理生化特征進行觀察,把所得到的結果與《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第八版)比較,鑒定此菌為標樁菌屬(Stigmatella sp.);采用SPME/GC/MS方法對菌體產(chǎn)生的揮發(fā)性物質進行鑒定,WXNXJ-B菌主要產(chǎn)生酮類和雜環(huán)類化合物;以菌體生

3、物量為目標,采用單因素和正交實驗優(yōu)化了菌株的生長條件,最佳生長條件和培養(yǎng)基為:麥芽糖8 g/L,酵母粉6 g/L,胰蛋白胨6 g/L,D-葡萄糖酸鈉5 g/L,CaCl21.5 g/L,MgSO40.5 g/L,初始pH為7.0,培養(yǎng)溫度為28℃。
　　 采用MTT法評價活性代謝產(chǎn)物的細胞毒性和對外界環(huán)境的穩(wěn)定性。結果表明Stigmatella WXNXJ-B所產(chǎn)生的活性物質對B16細胞、人肝癌細胞HepG2和人乳腺癌細胞DMA

4、-MB231有很高的活性,在不高于70℃的條件下活性物質穩(wěn)定,對自然光和紫外光不敏感,在pH3-10時較穩(wěn)定。對代謝產(chǎn)物進行定性分析發(fā)現(xiàn)樹脂提取液中主要含有甙類、甾體類、生物堿類和內酯類物質。
　　 以B16腫瘤細胞系為模型,采用液液萃取、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱、低壓C18柱和HPLC分離、純化和制備等手段分離純化出一高活性物質,通過對其NMR、LC/MS、MALDI-TOF MS/MS、IR和UV等圖譜的解析

5、,確定其分子量為435 Da,化學式為C29H25NO3以及結構式為:
　　 根據(jù)習慣命名法、系統(tǒng)命名法,并參考國際慣例,給出了化合物C29H25NO3的俗名(Quinoxalone,喹樂霉素)和系統(tǒng)名稱([1R,6R]-5-(6-benzyl-quinolin-3-ylmethyl)-6-phenyl-3,7-dioxa-bicyclo[4.1.0]heptan-3-One,5-(6-苯甲基-喹啉-3-基甲基-6-苯基-3-7

6、-二氧-雙環(huán)[4.1.0]庚烷-3-酮)。通過教育部科技查新文獻檢索中心華東理工大學站對喹樂霉素的名稱、結構、性質以及研究現(xiàn)狀進行了查新工作(查新號為201036000L060001),未發(fā)現(xiàn)具有相同結構的物質被報道。
　　 對Stigmatella WXNXJ-B產(chǎn)喹樂霉素的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。優(yōu)化后的最佳條件為培養(yǎng)時間6天,接種量8％,溫度28℃,裝液量80 mL/500 mL,pH為6.5;考察了無機離子、銨鹽與磷酸鹽、前體

7、物質、氨基酸對喹樂霉素發(fā)酵的影響,結果表明Ca2+、Mg2+、Zn2+、Co2+和Na+有促進作用,Li2+有抑制作用,銨鹽不高于2 g/L具有促進作用;磷酸鹽不起作用;0.4 g/L乙酸鈉和0.8 g/L丙酸鈉分別可以提高至905.15μg/L和878.42μg/L;適量的乙醇、乳酸、異丙醇、異戊醇、色氨酸、酪氨酸、丙氨酸、蛋氨酸和谷氨酸有促進作用;纈氨酸對喹樂霉素的合成有抑制作用。
　　 采用Plackett-Burman設

8、計法篩選出培養(yǎng)基中脫脂奶粉、MgSO4·7H2O和葡萄糖對喹樂霉素的產(chǎn)量影響較大;采用Box-Behnken實驗設計優(yōu)化出三個影響因子水平:葡萄糖5.12 g/L,MgSO4·7H2O0.8 g/L和脫脂奶粉7.92 g/L,在這個條件下喹樂霉素的產(chǎn)量可達到1205.08μg/L,比優(yōu)化前提高了59.69％。同時通過對大孔樹脂的靜態(tài)吸附實驗,篩選出對喹樂霉素吸附效果較好的D101樹脂。
　　 體外毒性實驗表明,喹樂霉素對B16、

9、HepG2、CT-26和DMA-MB231腫瘤細胞系都有很強細胞毒性,對這四種腫瘤細胞的IC50分別為2.41、5.4、2.83、1.78μg/mL。與對照Taxol和Epothilone B相比,其毒性與Taxol相近;喹樂霉素對正常小鼠的脾臟細胞的毒性較低(IC50＞700μg/mL)。因此,喹樂霉素是選擇性地作用于細胞。
　　 B16細胞被不同濃度的喹樂霉素處理24 h后于倒置顯微鏡下,可見B16細胞數(shù)量減少,形態(tài)變圓:掃

10、描電鏡觀察到B16細胞表明大量微絨毛消失,并可見細胞表面出泡以及凋亡小體的形成;熒光電鏡下B16細胞核皺縮,細胞核熒光呈顆粒狀或片絮狀,可見致密強熒光。DNA Ladder電泳結果顯示B16細胞的DNA呈梯度,含有180-200 bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段。采用流式細胞儀檢測碘化丙啶單染色的B16細胞周期發(fā)現(xiàn),喹樂霉素主要將腫瘤細胞阻滯在S期和G2/M期,阻止細胞分裂和進入細胞增殖周期,導致B16腫瘤細胞凋亡。B16細胞經(jīng)過碘化丙啶和羅丹