2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、殺稻瘟菌素是一類肽核苷類抗生素。自1958年被發(fā)現(xiàn)以來,它被大規(guī)模用于取代汞制劑農(nóng)藥來防治稻瘟病、白粉病。此外,由于殺稻瘟菌素在真核生物基因工程中可以有效地篩選突變株,它被廣泛的應(yīng)用于生物研究。殺稻瘟菌素的生物合成基因簇于2003年被報(bào)道,但是由于殺稻瘟菌素的天然產(chǎn)生菌的遺傳操作難以進(jìn)行,幾乎沒有關(guān)于殺稻瘟菌素生物合成的體內(nèi)研究的報(bào)道。因此目前報(bào)道的生物合成基因簇的完整性還有待商榷。我們通過構(gòu)建殺稻瘟菌素天然產(chǎn)生菌 S. griseoc

2、hromogenes的基因組文庫,并結(jié)合已發(fā)表的序列,運(yùn)用染色體步移技術(shù)從基因組文庫中釣取出了柯斯質(zhì)粒7D11。測序結(jié)果表明,7D11包含了殺稻瘟菌素已發(fā)表的DNA序列及其下游的8.6 kb的片段。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,這8.6 kb序列中所包含的基因與殺稻瘟菌素生物合成并無關(guān)聯(lián)。
  為了深入研究殺稻瘟菌素的生物合成機(jī)制,我們通過4次同源重組的方法,將7D11中的插入序列嫁接到了變鉛青鏈霉菌S. lividans HX

3、Y16的染色體上,得到突變株S. lividans LL2。生測結(jié)果表明,LL2并不能對殺稻瘟菌素生測指示菌(紅酵母)產(chǎn)生明顯的抑制作用。進(jìn)一步的發(fā)酵結(jié)果表明,突變株LL2發(fā)酵產(chǎn)物中包含了一種殺稻瘟菌素的衍生物‐去氨基羥化殺稻瘟菌素(deaminohydroxymildiomycin,OH‐BS)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在HXY16中的染色體存在一種可能的殺稻瘟菌素脫氨酶基因SLBSD。體外生化實(shí)驗(yàn)表明,大腸桿菌融合表達(dá)的蛋白SLBSD可

4、以將殺稻瘟菌素轉(zhuǎn)化為OH‐BS。出人意料的是,融合表達(dá)的SLBSD在體外不僅可以以殺稻瘟菌素為底物,它還可以轉(zhuǎn)化另一種核苷類抗生素米多霉素以及殺稻瘟菌素合成的中間產(chǎn)物胞嘧啶葡萄糖醛酸(cytosylglucuronic acid,CGA)。而這兩個(gè)化合物被確認(rèn)是可以在野生型變鉛青鏈霉菌中進(jìn)行異源合成的。緊接著,我們在 HXY16中敲除 SLBSD后得到突變株S. lividans WJ1,其對于殺稻瘟菌素的抗性從大于200μg/ml下降

5、到了100μg/ml。體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)表明:SLBSD是天然存在于變鉛青鏈霉菌染色體上的一個(gè)殺稻瘟菌素抗性基因。
  在嫁接有殺稻瘟菌素生物合成基因簇的菌株LL2中,我們通過敲除SLBSD得到突變株S. lividans WJ2。發(fā)酵結(jié)果顯示,在WJ2中OH‐BS不再產(chǎn)生,并且WJ2可以正常的異源表達(dá)殺稻瘟菌素。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步證明了WJ2中包含了完整的殺稻瘟菌素生物合成基因簇。為了深入的檢測 WJ2中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,以及亞鐵離

6、子對殺稻瘟菌素生物合成的影響,將WJ2在種子/發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵并用LC‐MS檢測發(fā)酵液。檢測結(jié)果表明,WJ2的發(fā)酵液中存在一個(gè)新的次級代謝產(chǎn)物。通過質(zhì)譜以及二級質(zhì)譜的分析,證實(shí)這個(gè)代謝產(chǎn)物為去甲基殺稻瘟菌素。
  為了探究造成去甲基殺稻瘟菌素積累的原因,我們探索了已報(bào)道的殺稻瘟菌素生物合成基因簇。生物信息學(xué)分析揭示 blsL可能編碼一個(gè)N‐甲基轉(zhuǎn)移酶,因此推斷 blsL可能與去甲基殺稻瘟菌素的形成有關(guān)系。基因置換的結(jié)果表明,在

7、blsL的被壯觀霉素抗性基因置換的突變株變鉛青鏈霉菌WJ3中不再產(chǎn)生殺稻瘟菌素,并且大量積累去甲基殺稻瘟菌素。同時(shí),blsL基因回補(bǔ)菌株可以正常產(chǎn)生殺稻瘟菌素,證實(shí)在WJ3中不存在極性效應(yīng)。
  在殺稻瘟菌素生物合成基因簇中,blsF的功能未知。通過 BlastP搜索發(fā)現(xiàn),BlsF與米多霉素生物合成基因簇中MilL有一定同源性。但是milL并不是米多霉素生物合成的必需基因?;蛑脫Q的結(jié)果表明,在blsF被壯觀霉素抗性基因置換后的突

8、變株變鉛青鏈霉菌 WJ4中,殺稻瘟菌素的產(chǎn)量大大提高。不僅如此,在未經(jīng)純化處理的WJ4的發(fā)酵液中還檢測到了大量殺稻瘟菌素生物合成中間體CGA,進(jìn)一步表明blsF可能是殺稻瘟菌素生物合成中一個(gè)途徑專一行的調(diào)節(jié)基因。
  在殺稻瘟菌素生物合成基因簇中,blsE編碼了一個(gè)Radical SAM家族的蛋白,其功能未知。為了開展BlsE的體外生化實(shí)驗(yàn),需要通過體內(nèi)研究確定BlsE的底物?;蛑脫Q的結(jié)果表明,在用壯觀霉素抗性基因置換了blsE

9、的突變株變鉛青鏈霉菌 WJ5的發(fā)酵液中,殺稻瘟菌素不再產(chǎn)生,而殺稻瘟菌素生物合成的中間體 CGA得到了大量積累。在米多霉素生物合成途徑的研究中,blsE的同源基因milG的基因置換結(jié)果也得到了類似的結(jié)果。這證實(shí)了BlsE的底物為CGA,為之后BlsE的體外實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。
  最近的體外生化實(shí)驗(yàn)表明,在殺稻瘟菌素生物合成中經(jīng)歷了一個(gè)脫羧‐再羧化的過程。但是在之前對基因簇的分析中,并未找到與羧化相關(guān)的基因。深入分析發(fā)現(xiàn),BlsI可能

10、是一個(gè)潛在的羧化酶。它與生物素羧化酶具有一定的同源性?;蛑脫Q的結(jié)果表明,在壯觀霉素置換了blsI的突變株變鉛青鏈霉菌 WJ6的發(fā)酵液中,殺稻瘟菌素不再產(chǎn)生,并且還檢測到了一個(gè)分子量為227的次級代謝產(chǎn)物。二級質(zhì)譜分析表明,這個(gè)次級代謝產(chǎn)物包含了一個(gè)胞嘧啶結(jié)構(gòu),推測其為殺稻瘟菌素生物合成中的一個(gè)中間產(chǎn)物。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推翻了之前關(guān)于BlsI的功能的推測。
  通過在變鉛青鏈霉菌中成功異源表達(dá)殺稻瘟菌素,我們得到了一株殺稻瘟菌素人工產(chǎn)

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