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文檔簡介
1、目的:造血干細(xì)胞移植目前已經(jīng)成為治療多種惡性疾病的有效方法之一,臍血因具有移植物抗宿主病發(fā)生率低的優(yōu)點,成為造血干細(xì)胞的主要來源。但是,有兩大因素阻礙了臍血造血干細(xì)胞的廣泛應(yīng)用。一是臍血中所含的造血干/祖細(xì)胞數(shù)目少,不能滿足移植的需要,尤其是對一些難治性的血液系統(tǒng)疾病,如范可尼貧血、慢性髓系白血病和重型再生障礙性貧血。二是臍血移植同骨髓和外周血移植相比其植入速度慢,尤其是血小板的恢復(fù)時間延長,持續(xù)的血小板減少不僅會增加患者出血死亡的可能
2、性,而且反復(fù)的血小板輸注易導(dǎo)致血小板無效輸注及病毒感染機會增加等一系列問題,成為困擾臨床的一大難題。臍血中含有大量的干/祖細(xì)胞,具有擴增、分化的潛能,因此取出部分的臍血進行巨核系祖細(xì)胞的體外擴增及適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)成熟,然后與未擴增部分一并輸注回受者體內(nèi),從而加速體內(nèi)血小板的恢復(fù)是有望解決這一難題的重要途徑。近年來大量的研究證實,多種細(xì)胞因子如Fit-3配體(FL)、血小板生成素(TPO)、干細(xì)胞因子(SCF)、白介素-3(IL-3)等能支持臍
3、血巨核系祖細(xì)胞的定向擴增,且效果明顯優(yōu)于骨髓及外周血造血干細(xì)胞。但是,擴增后的巨核祖細(xì)胞是否具有體內(nèi)功能,能否向成熟的巨核細(xì)胞分化尚未證實,而且關(guān)于短期的擴增效果尚未涉及。目前已有少數(shù)研究確認(rèn)體外擴增后的巨核祖細(xì)胞可以植入非糖尿病/免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠動物模型,但關(guān)于移植后的巨核祖細(xì)胞在體內(nèi)分化及成熟的研究尚未見到。本文以臍血CD34+造血干細(xì)胞為研究對象,應(yīng)用含有TPO、SCF、IL-3、IL-6不同因子組合的無血清培養(yǎng)體
4、系誘導(dǎo)其向巨核系分化和擴增,并對其植入NOD/SCID小鼠模型后的植入水平進行檢測。 方法:1.臍血CD34+細(xì)胞的分離及體外擴增臍血取自健康足月妊娠的胎盤組織,枸櫞酸鈉抗凝的血袋保存,4-6小時內(nèi)進行CD34+細(xì)胞分離純化。Percol密度梯度離心法收集單個核細(xì)胞(MNC),采用免疫磁珠法,按CD34細(xì)胞分選試劑盒說明純化細(xì)胞。將CD34+細(xì)胞接種于含Stem SpanTM SFEM無血清培養(yǎng)基的24孔板中,加入四種不同細(xì)胞因
5、子。根據(jù)細(xì)胞因子不同組合分為3組(1)TPO+SCF+HL-3+IL-6組;(2)TPO+SCF+IL-3組;(3)TPO+SCF組。 2.體外擴增后臍血巨核細(xì)胞生物學(xué)特性的研究(1)巨核細(xì)胞表面標(biāo)志的表達收集第3、7、10、14天的細(xì)胞,熒光顯微鏡檢測細(xì)胞表面標(biāo)志CD42b、CD41a、CD61和粘附因子標(biāo)志CD49d、CD49e、CD11a、CD54的表達。 (2)巨核細(xì)胞凋亡的檢測擴增后的細(xì)胞用Annexin WF
6、ITC和碘化丙錠(PI)溶液處理后,流式細(xì)胞儀進行檢測。 (3)巨核細(xì)胞形成單位(CFU-Mk)檢測將細(xì)胞接種于含人甲基纖維素培養(yǎng)基的24孔板中,在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng),進行CFU-GM集落計數(shù),培養(yǎng)前后進行對比。 (4)多倍體巨核細(xì)胞的檢測擴增后的細(xì)胞用含有核糖核酸酶(RNase)的碘化丙啶(PI)緩沖液進行處理后,使DNA染色,在流式細(xì)胞儀上對CD41+細(xì)胞進行多倍體檢測。 (5)巨核細(xì)胞特異
7、性基因的表達按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis試劑盒說明合成cDNA。用熒光定量PCR鑒定基因β-actin、APAF-1、GATA-1、NF-E2、HPRT、GPIIb、TXS的表達。 3.體內(nèi)功能檢泐(1)體外擴增的巨核細(xì)胞移植入NOD/SCID小鼠16只6-8周的NOD/SICD小鼠無菌條件下飼養(yǎng),分為4組,經(jīng)亞致死量放射線(350 cGy)全身照,4-6h內(nèi)將細(xì)胞尾靜脈注入照
8、射后的小鼠體內(nèi)。(1)實驗組I:TPO+SCF+IL-3+IL-6擴增7-10天的細(xì)胞。(1)實驗組II:TPO+SCF擴增7-10天的細(xì)胞。(3)陽性對照組:同等數(shù)量的CD34+細(xì)胞。(4)陰性對照組:同等體積的生理鹽水。 (2)小鼠骨髓的檢測小鼠處死后無菌條件下取小鼠的股骨與脛骨骨髓細(xì)胞,熒光顯微鏡檢測人巨核細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD41、CD45的表達。 (3)小鼠外周血中人血小板的檢測小鼠處死后心臟取血,熒光顯微
9、鏡檢測鼠源性和人源性抗體CD41的表達。 結(jié)果:1.分離獲得的CD34+細(xì)胞在體外可以有效擴增,三個實驗組的原始巨核細(xì)胞(CD34+/CD41+)均在第7天達最高值,且添加IL-3和IL-6的細(xì)胞因子組合優(yōu)于未添加組;三個實驗組CD41+、CD42b+、CD61+細(xì)胞的擴增倍數(shù)隨培養(yǎng)時間的延長表達量逐漸增高,三組之間有顯著性差異。粘附因子CD49d+、CD11a+、CD49e+的表達均在培養(yǎng)第7天達到最高水平,而CD54+的表達
10、量呈下降趨勢。 2.SCF、TPO組合在擴增第7天并不能顯著抑制細(xì)胞凋亡,加入IL-3和IL-6后,Annexin V陽性細(xì)胞由(8.264±2.49)%降至(3.51±1.24)%。CFU-MK的數(shù)量在第10天時最高,且8倍體及8倍體以上的巨核細(xì)胞所占的的百分比增加,即成熟產(chǎn)板型巨核細(xì)胞增加。熒光定量PCR測定GATA-1、NF-E2、GPIIb的相對表達量在實驗I組第7天水平最高,GATA-1、GPIIb的相對表達量在實驗I
11、I組第7天達到最高水平而NF-E2在第10天降到最低之后逐漸回升,凋亡轉(zhuǎn)錄因子APAF-1的相對表達逐漸增多,實驗III組GATA-1、NF-E2、GPIIb的相對表達量在第10天達到水平之后下降,TXS、HPRT的測定基本通NF-E2。 3.移植入NOD/SCID小鼠體內(nèi)后,1周后小鼠骨髓均有人臍血細(xì)胞植入,CD45的表達量在兩實驗組小鼠的骨髓中為(5.47±1.76)%、(6.63±0.57)%,CD41+細(xì)胞為(1.70±
12、0.17)%、(2.21±0.31)%。小鼠外周血中人血小板在移植后3天就可測到,兩實驗組分別再第7天和14天達到高水平(為20.46%和24.37%)。 結(jié)論:1.三種因子組合TPO+SCF+IL-3+IL-6、TPO+SCF+IL-3和TPO+SCF在體外均可使臍血巨核細(xì)胞有效擴增,通過對擴增后巨核細(xì)胞的生物學(xué)特性的鑒定,認(rèn)為因子組合TPO+SCF+IL-3+IL-6在第7-10天的擴增效率最高。 2.將擴增后的臍血
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