磷氮霉素生物合成基因簇中的調(diào)控基因的功能研究及幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因的改造.pdf

1、磷氮霉素(PNs，也稱Phoslactomycins，PLMs)是一類具有抗真菌、抗腫瘤活性的聚酮類化合物，它除了具有蛋白磷酸化酶抑制劑的功能外，還對(duì)于黃瓜灰霉病菌有著良好的防治效果。本課題探索磷氮霉素的生物合成途徑，通過(guò)分析宿主菌(StreptomycesplatensisSAM-0654)磷氮霉素生物合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因，采用刪除，添加，取代或重組等手段研究各基因的功能。
　　 首先補(bǔ)全了磷氮霉素生物合成基因簇。與Str

2、eptomycesHK803相比，之前所篩選得到的基因簇缺少與P450氧化酶相關(guān)的基因。通過(guò)設(shè)計(jì)P450基因的探針，篩選基因組文庫(kù)得到到含有目標(biāo)P450基因以及其他缺失基因的fosmid，補(bǔ)全了基因簇。
　　 其次研究了磷氮霉素生物合成基因簇中調(diào)控基因的功能。采用了三種方法。一是對(duì)刪除了調(diào)控基因pnR2的突變株△pnR2做了回補(bǔ)?！鱬nR2突變體發(fā)酵不產(chǎn)生磷氮霉素(PNs)，表明pnR2基因是合成磷氮霉素的正調(diào)控基因。本文在構(gòu)建

3、了正確的pnR2回補(bǔ)質(zhì)粒(pZJ1-19-1)后，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方式導(dǎo)入了△pnR2突變株mtR2中，所獲得正確回補(bǔ)突變株命名為mZJhb-R2。對(duì)mZJhb-R2進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)可以產(chǎn)生磷氮霉素，其產(chǎn)量與野生型相比基本一致，證實(shí)pnR2是合成磷氮霉素的正調(diào)控基因。二是在野生型菌株中增加一個(gè)pnR2基因拷貝。將pnR2回補(bǔ)質(zhì)粒pZJ1-19-1接合轉(zhuǎn)移的方式導(dǎo)入了野生型菌株獲得增加一個(gè)拷貝pnR2基因的突變株mZJ-R2-wt，對(duì)mZJ-R

4、2-wt進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)可以產(chǎn)生磷氮霉素，其產(chǎn)量與野生型相比高將近一倍，再一次證實(shí)pnR2是合成磷氮霉素的正調(diào)控基因。三是用RT-PCR的方法研究了磷氮霉素生物合成基因簇中調(diào)控基因?qū)铣闪椎顾毓羌苡嘘P(guān)的結(jié)構(gòu)基因pn1、pn6、pn8以及后修飾基因pnT1表達(dá)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失調(diào)控基因pnR1的突變株mLW-R1和缺失調(diào)控基因pnR2的突變株mLW-R2，其pn1、pn6和pnT1的表達(dá)量都比野生生顯著下降，而pn8的表達(dá)未見(jiàn)明顯影響。