玫瑰黃鏈霉菌幾丁質酶基因及抗生素合成基因簇研究.pdf

1、鏈霉菌是一種廣泛分布于土壤中的革蘭氏陽性菌，是重要的天然抗生素和幾丁質酶產(chǎn)生菌。幾丁質酶可通過催化幾丁質的水解，破壞植物病原真菌細胞壁的主要組分，從而起到抑制植物病害發(fā)展的作用。本研究應用平板稀釋法從棉花根圍土壤樣品中分離到了360株鏈霉菌，采用雙層平板法測定它們對棉花黃萎病菌生長的抑制作用。此外還對本實驗室保存的24株生防鏈霉菌進行了抑菌活性測定，這24株生防鏈霉菌對棉花黃萎菌都表現(xiàn)出很好的抑菌效果。 對表現(xiàn)抑菌活性的185

2、株拮抗鏈霉菌菌株使用透明圈法測定，發(fā)現(xiàn)其中115株有幾丁質酶活性。采用水煮法、STE法、SDS法、微波法等4種方法提取鏈霉菌的DNA，并以鏈霉菌16SrDNA引物來擴增提取到的DNA。結果表明除STE法外，其他3種方法所提樣品都能擴增出預想的約1.6Kb的片段，且利用水煮法可以更快速、有效的提取出適用于PCR分子探測的鏈霉菌DNA。 從GenBank中檢索到26個鏈霉菌幾丁質酶基因序列，根據(jù)保守序列，設計了兩對PCR引物(Ch

3、i-1/Chi-2和Chi-3/Chi-4)。對115株有幾丁質酶活性的菌株進行PCR擴增，有112株可以擴增出預期的特異片段。其中48株菌株對兩對引物都有擴增產(chǎn)物，92株對Chi-1/Chi-2引物有產(chǎn)物，68株對Chi-3/Chi-4引物有產(chǎn)物。分別選擇兩菌株的兩對引物組合的擴增產(chǎn)物測序，BLAST比較發(fā)現(xiàn)這些產(chǎn)物與其對應的幾丁質酶基因類型一致，從而證明了兩對引物的可靠性，建立了一套可以快速鑒定幾丁質酶產(chǎn)生菌的PCR探測方法。

4、 Men-myco-93-63菌株是從馬鈴薯瘡痂病自然衰退土壤中分離得到鏈霉菌菌株，經(jīng)鑒定為玫瑰黃鏈霉菌。該菌及其次生代謝產(chǎn)物對不同致病力的棉花黃萎病菌及其它多種植物病原菌均表現(xiàn)較強的抑制作用。在本實驗室前期研究的基礎上進行了該菌株生防相關基因克隆的研究： 1.克隆了Men-men-93-63幾丁質酶基因C的催化域區(qū)域；PCR擴增得到包含信號肽區(qū)、纖維素結合區(qū)、幾丁質結合區(qū)三個結構功能域的變鉛青鏈霉菌幾丁質酶C(S.liv

5、idansChiC)基因片段，此片段與催化域部分、質粒pET23b(+)連接，構建成表達載體pLCH轉化大腸桿菌，轉化子誘導表達后在幾丁質酶培養(yǎng)基上表現(xiàn)幾丁質酶蛋白活性。 2.利用pKC505柯斯質粒建立了玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63的柯斯質粒文庫，提取文庫中克隆的質粒，再轉化到S.lividans中。以棉花黃萎病菌作為指示菌，篩選可以抑制黃萎病菌生長的轉化子，未篩選到陽性克隆。 3.根據(jù)聚酮合成酶類(P

6、KS)、氨基糖苷類(STR)和非核糖體含硫多肽類(NRPS)抗生素合成基因簇中的保守序列設計引物，對Men-myco-93-63基因組DNA進行了PCR擴增，PKS引物得到了約500bp片段，而STR引物得到750bp的片段。經(jīng)測序和Blast比較發(fā)現(xiàn)：其序列與預期的片段沒有相似性，其是否與抗生素合成相關還需要進行基因阻斷試驗來驗證。 4.對Men-myco-93-63含有的抗性基因進行探測，通過抗生素抗性基因PCR引物，對M

7、en-myco-93-63進行擴增，發(fā)現(xiàn)該菌株含有β-內酰胺酶基因，對氨芐青霉素具有抗性，使用氨芐青霉素對其進行了驗證。利用pKC1139質粒構建了Men-myco-93-63菌株的質粒文庫，利用PCR引物篩選文庫，篩選到兩個陽性克隆，分別測序發(fā)現(xiàn)插入片段都包含有完整的β-內酰胺酶基因。對片斷中的內酰胺酶基因的兩端序列ORF進行Blast分析，在GenBank中未發(fā)現(xiàn)相似的蛋白序列，這兩個片段是否與抗生素合成相關還需要進行基因阻斷來驗證