鏈霉菌LC6和LZ35中兩個隱性次級代謝基因簇的激活及生物合成研究.pdf

1、天然產物是新藥發(fā)現的源泉，而微生物來源的次級代謝產物又是天然產物最重要的來源之一。微生物次級代謝產物的合成基因通常成簇排列在基因組中，為其編碼產物預測和生物合成研究提供了便利。隨著基因測序技術的發(fā)展和基因分析方法的成熟，人們發(fā)現許多放線菌，特別是鏈霉菌中存在豐富的次級代謝產物合成基因簇，然而僅有一小部分可以與已知代謝物相關聯(lián)，更多的是功能未知的隱性基因簇，顯示了鏈霉菌巨大的新天然產物合成潛力。
　　本研究論文主要通過基因序列指導的

2、天然產物發(fā)現策略，嘗試激活兩條沉默次級代謝基因簇，從而獲得新活性天然產物。具體包括:1）Streptomyces sp.LC6中一個五酮安莎基因簇的激活及其合成功能探究;2）Streptomyces sp.LZ35中一個NRPS-FAS雜合基因簇的激活及其異源表達。
　　安莎霉素是一類以3-氨基-5-羥基苯甲酸(AHBA)為起始單元的Ⅰ型聚酮類天然產物，主要分布在放線菌中，具有廣泛強效的生物活性。Streptomyces sp.L

3、C6是從廈門紅樹林植物秋茄中分離得到的一株AHBA合酶基因陽性菌，前期研究表明其基因組中包含一個新型五酮安莎霉素合成基因簇(jlm)，但在實驗室培養(yǎng)條件下未能從中分到相應的安莎類化合物，提示該基因簇可能處于沉默或低表達狀態(tài)。本課題對該基因簇開展了以下研究:1）在Streptomyces sp.LC6中分別組成型表達該安莎基因簇中可能的正調控基因。本課題組張娟利同學從SARP組成型表達突變菌株中，分離獲得了一類具有新穎骨架的五酮型安莎霉素

4、二聚物juanlimycins。2)通過基因敲除和代謝譜比較確證了jlm基因簇負責編碼juanlimycins。Jlm包括一套完整的AHBA合成基因(jlmGHIKLMN)、PKS基因(jlmABC)、酰胺合酶基因(jlmD)和其它多個與調控和后修飾相關的基因。3）為了探宄juanlimycins的二聚化機制，我們將jlm的核心基因(jlm A-E)在AHBA前體供應豐富的Streptomyces sp.LZ35中進行了異源表達。HPL

5、C檢測顯示異源表達突變株有明顯的代謝差異峰出現，但LC-MS檢測結果顯示該差異峰分子量遠小于juanlimycins和五酮單體，由于該差異峰產量太低，尚未能鑒定其結構。
　　Streptomyces sp.LZ35是一株海洋放線菌，其基因組中存在一個隱性NRPS-FAS雜合基因簇has。本課題從調控基因組成型表達調控基因和異源表達兩方面嘗試獲得該基因簇編碼的新脂肽類化合物:1）在Streptomyces sp.LZ35中組成型表達

6、has基因簇中分屬IclR和LuxR家族的正調控基因。IclR家族調控基因組成型表達突變株能使培養(yǎng)基變?yōu)槊黠@的淺綠色，HPLC代謝譜比較發(fā)現有明顯差異峰，但產物追蹤分離和結構鑒定顯示差異峰為分支酸降解產物和離子螯合劑，并非預期的脂肽類化合物。LuxR家族調控基因組成型表達突變株的代謝譜與野生型有顯著差異，差異峰與后期通過其它策略獲得的脂氨基酸類化合物一致。2）對has基因簇的核心部分進行了DNA拼接(52.4 kb)，但是拼接后的has

7、基因簇導入異源宿主Streptomyces lividans SBT5后，未檢測到異源表達產物。
　　綜上所述，本論文通過基因組挖掘策略成功激活了鏈霉菌LC6中的沉默的新型五酮安莎霉素合成基因簇和鏈霉菌LZ35中沉默的脂氨基酸合成基因簇，證明了操縱調控基因表達是簡單有效的隱性基因簇激活手段，一方面為基因序列指導下的天然產物分離提供了例證，另一方面顯示了鏈霉菌巨大的新天然產物挖掘潛力，為以后人們從隱性基因簇中獲得新天然產物提供了借鑒