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文檔簡介
1、吸水鏈霉菌17997是該所從中國土壤中分離得到的格爾德霉素(GDM)產(chǎn)生菌。GDM屬于苯安莎類抗生素。最先發(fā)現(xiàn)GDM具有抗原蟲和抗腫瘤作用,最近我所的研究發(fā)現(xiàn)GDM還具有良好的抗病毒活性。國外的研究表明GDM的這些生物學(xué)活性是因為它能特異性地抑制熱休克蛋白90的ATP/ADP結(jié)構(gòu)域,下調(diào)多種Hsp90的靶蛋白功能所致,包括酪氨酸激酶、類固醇激素受體和轉(zhuǎn)錄因子等。GDM作為Hsp90的特異性抑制劑,成為在抗癌和抗病毒領(lǐng)域中非常有潛力的藥物
2、。但因為GDM肝毒性比較大,水溶性不好,所以尋找其低毒可溶性好的衍生物成為當(dāng)今研究的主要目標(biāo)。GDM的一種衍生物17-烯丙氨基-17-脫甲氧基GDM(17-AAG)正在美國進(jìn)行Ⅱ期臨床實(shí)驗。 已知安莎類抗生素的生物合成是以3-氨基-5-羥基苯甲酸(AHBA)為起始單位,由Ⅰ型聚酮合酶(PKS)催化順序加上乙二酸,丙二酸或者甲氧基丙二酸等延伸單位,在酰胺合酶參與下形成聚酮體骨架,然后再進(jìn)行后續(xù)的加工。在對GDM生物合成基因簇的研究
3、中,本實(shí)驗室在S.hygroscopicus17997中曾發(fā)現(xiàn)了苯醌型和萘醌型兩種AHBA生物合成基因和與之連鎖的兩個PKS基因簇,但其中未包括GDM的后修飾基因。本研究根據(jù)GDM的后修飾基因-氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶基因(gdmN)的保守序列設(shè)計PCR引物,在S.hygroscopicus17997基因組中擴(kuò)增出了732bp的基因片段,通過測序和同源比較,證實(shí)該基因片段與S.hygroscopicusNRRL3602的gdmN有94%的同源性。
4、利用該基因片段的引物,進(jìn)行菌落PCR篩選S.hygroscopicus17997的基因組文庫,獲得了6個陽性克隆,并利用732bp的PCR產(chǎn)物作為探針對陽性克隆進(jìn)行Southernblot驗證和定位。選擇CT-4陽性柯斯質(zhì)粒進(jìn)行亞克隆測序,將測得的28.356kbDNA序列進(jìn)行BLAST和ORF分析,證實(shí)與公布的S.hygroscopicusNRRL3602GDM生物合成基因的部分序列基本一致。CT-4柯斯質(zhì)??寺≈型庠葱蛄锌赡馨?2
5、個基因:與gdmA3基因同源的PKS基因、酰胺合酶基因(gdmF)、單加氧酶基因(gdmM)、氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶基因(gdmN)、與甲氧基丙二酰-酰基攜帶蛋白合成相關(guān)的5個基因(gdmH、I、J、K和G)、LuxR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因(gdmRⅡ)、氨基奎尼酸合成酶基因(gdmO),細(xì)胞色素P450氧化還原酶基因(gdmP)。從17997的基因組中通過PCR延伸獲得另一LuxR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因(gdmRⅠ)。 LuxR家族調(diào)節(jié)基因g
6、dmRⅠ和gdmRⅡ阻斷變株(RⅠ和RⅡ變株)均不產(chǎn)生GDM,說明這兩個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因可能是GDM生物合成的正調(diào)控基因。S.hygroscopicu17997發(fā)酵培養(yǎng)的生長期為12-48h,合成期為48-96h。提取不同培養(yǎng)時間的S.hygroscopicu17997、RⅠ和RⅡ變株的總RNA,通過半定量RT-PCR研究了兩個調(diào)節(jié)基因gdmRⅠ和gdmRⅡ和GDM生物合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)系。結(jié)果表明gdmRⅠ和gdmRⅡ基因在72h開始轉(zhuǎn)
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