玫瑰孢鏈霉菌中達(dá)托霉素的生物合成途徑優(yōu)化.pdf

1、達(dá)托霉素是一種從玫瑰孢鏈霉菌（Streptomyces roseosporus）發(fā)酵液中提取的環(huán)脂肽類抗生素，對(duì)革蘭氏陽性菌有很強(qiáng)的抗菌活性，被認(rèn)為是萬古霉素的最佳替代品。目前，對(duì)于達(dá)托霉素的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、作用機(jī)制以及合成過程已經(jīng)有了相對(duì)深入的研究，通過代謝工程、隨機(jī)突變等方法的運(yùn)用，達(dá)托霉素的產(chǎn)量也有提高，但發(fā)酵單位依然不高，亟需采取更先進(jìn)的技術(shù)進(jìn)行大幅度高產(chǎn)改造。
　　首先，通過融合催化起始反應(yīng)的兩個(gè)酶，DptE和dptF，提高了

2、癸酸的活化效率，加快了達(dá)托霉素合成速率。對(duì)常見的幾種環(huán)脂肽類抗生素的結(jié)構(gòu)和脂肪酸側(cè)鏈活化相關(guān)的基因進(jìn)行了分析，推測LptEF是編碼?；o酶A連接酶和酰基載體蛋白的融合體，并據(jù)此構(gòu)建了DptE和DptF的融合蛋白。體外反應(yīng)證實(shí)了融合蛋白DptEF比DptE/DptF的催化速率提高了一倍，融合蛋白DptEF能夠更高效活化癸酸。并構(gòu)建了dptE和dptF的融合菌株FdptEF，搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明，F(xiàn)dptEF菌株的達(dá)托霉素產(chǎn)量明顯提高(26.7

3、％)，發(fā)酵周期提前24小時(shí)。在優(yōu)化補(bǔ)料量之后，F(xiàn)dptEF菌株的達(dá)托霉素產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高59.4％。
　　為進(jìn)一步體現(xiàn)DptE和dptF融合對(duì)生物合成效率的提升，本課題對(duì)犬尿氨酸的前體供應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化，加快了色氨酸向犬尿氨酸的轉(zhuǎn)化速率。達(dá)托霉素母核的第13個(gè)氨基酸犬尿氨酸(Kyn)，是非蛋白氨基酸。犬尿氨酸是由色氨酸代謝產(chǎn)生的，在鏈霉菌中，色氨酸被氧化成N-甲酰-L-犬尿氨酸，進(jìn)一步甲酰胺酶水解生成犬尿氨酸，最終水解生成鄰氨基苯甲

4、酸和L-丙氨酸。證實(shí)了在玫瑰孢鏈霉菌L30中，只含有一個(gè)甲酰胺酶SRO3365。對(duì)dptJ和sro3367的功能進(jìn)行分析，證實(shí)了主要是dptJ參與了達(dá)托霉素的合成，sro3367可能與初級(jí)代謝相關(guān)。利用強(qiáng)啟動(dòng)子ermEp分別高表達(dá)了dptJ、sro3367和sro3365，并敲除了sro3366，發(fā)現(xiàn)達(dá)托霉素的產(chǎn)量分別提高了56.4％(ermEp-dptJ)，25.9％(ermEp-sro3367)，73.7％（（ermEp-dptJ-