恰塔努加鏈霉菌納他霉素生物合成的途徑特異性調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、抗生素一般由生長在土壤中的鏈霉菌產(chǎn)生，其生物合成所需的基因通常成簇位于染色體上并受到途徑特異性調(diào)控基因的調(diào)控。這些調(diào)控基因位于次級代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的最底層，只負(fù)責(zé)對相應(yīng)抗生素基因簇中部分或全部基因的調(diào)控。
　　 最近從恰塔努加鏈霉菌L10中克隆出納他霉素生物合成基因簇。通過體外凝膠阻滯電泳實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)scnRⅡ直接結(jié)合在scnS2，scnI,scnJ,sncK，scnA，scnE，scnS，scnD這些基因的啟動(dòng)子上并成片激活納他霉素生

2、物合成簇上合成基因，后修飾基因以及潛在的轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)，這種結(jié)合能力受到ScnRⅡ蛋白N端PAS結(jié)構(gòu)域的調(diào)節(jié)。
　　 對于scnI缺失株的轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SCnRⅡ的轉(zhuǎn)錄受到ScnRⅠ的正向調(diào)控。結(jié)合體外凝膠阻滯電泳以及Real-timePCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ScnRⅠ直接結(jié)合到scnRI-scnRⅡ基因間隔區(qū)增強(qiáng)scnRⅡ的轉(zhuǎn)錄。序列比對發(fā)現(xiàn)ScnRⅠ結(jié)構(gòu)域組成中含有AAA結(jié)構(gòu)域的保守模體WalkerA與WalkerB，通過體外ATP酶活

3、實(shí)驗(yàn)確定了ScnRⅠ蛋白具有ATP酶活的作用。為研究ATP酶活對于ScnRⅠ功能的作用，本文對WalkerA模體進(jìn)行定點(diǎn)突變后分別進(jìn)行體外表達(dá)與體內(nèi)回補(bǔ)，發(fā)現(xiàn)定點(diǎn)突變后的ScnRⅠ-SM幾乎失去對scnRⅠ缺失株的回補(bǔ)作用，從而證明了AAA結(jié)構(gòu)域的ATP酶活對ScnRⅠ行使功能至關(guān)重要。較為全面的揭示了ScnRⅠ的調(diào)控機(jī)制。
　　 通過納他霉素生物合成基因簇的測序我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)膽固醇氧化酶的編碼基因scnE。采用PCRtarge

4、ting的方法對其進(jìn)行敲除，經(jīng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)scnE敲除株的納他霉素產(chǎn)量下降約30％。由于膽固醇氧化酶在納他霉素生物合成以及后修飾等環(huán)節(jié)中并不發(fā)揮作用，結(jié)合SignalP的N端信號肽預(yù)測。本文推測scnE表達(dá)后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外將其特定底物氧化為信號小分子從而調(diào)控納他霉素的合成。
　　 本文通過對scnRⅠ與scnRⅡ的研究揭示了納他霉素生物合成中雙途徑特異性調(diào)控基因的級聯(lián)調(diào)控模式:ScnRⅠ通過結(jié)合在scnRⅡ啟動(dòng)子上游序列增強(qiáng)sc