海洋芽孢桿菌B-9987基因組文庫的構(gòu)建及Macrolactins生物合成基因簇的克隆與鑒定.pdf

1、海洋芽孢桿菌B-9987(Bacillus marinus)分離于我國渤海潮問帶植物鹽地堿蓬(Suaeda salsa)的根部,能夠產(chǎn)生豐富的Macrolactins類化合物。Macrolactins是一系列24元大環(huán)內(nèi)酯類化合物,主要分離自Actinomadura sp.和Bacillus sp.等海洋來源的微生物之中,具有廣泛的抗菌、抗病毒和抗腫瘤等生物學(xué)活性。本論文以海洋芽孢桿菌B-9987為研究對(duì)象,主要開展了以下研究工作:

2、r>　　首先,成功構(gòu)建了海洋芽孢桿菌B-9987的基因組文庫。從B-9987中提取基因組DNA,經(jīng)過Sau3AI部分酶切,脫磷,回收40kb左右的DNA片段,與經(jīng)XbaI酶切并脫磷,再用BamHI處理的載體SuperCosl相連接,連接產(chǎn)物經(jīng)包裝蛋白包裝,然后侵染宿主細(xì)胞Ecoli Trans10,構(gòu)建成海洋芽孢桿菌B-9987的基因組文庫。對(duì)該文庫進(jìn)行了質(zhì)量鑒定,結(jié)果表明:文庫的效價(jià)達(dá)5×105 cfu/mL,共得到2×104個(gè)陽性克

3、隆子,平均插入長度為35kb,插入率接近100％,覆蓋率為4.4。所建文庫的各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到要求,克隆子分裝保存于-80℃。基因組文庫的構(gòu)建為次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的克隆,以及異源表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
　　其次,對(duì)海洋芽孢桿菌B-9987的發(fā)酵條件與收獲時(shí)間進(jìn)行了摸索與優(yōu)化。結(jié)果表明:采用兩步法,以LB培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基,在28℃,200rpm振蕩培養(yǎng)16 h,獲得種子液,將種子按10％接種量接種至50/250mL三角瓶的Land

4、y發(fā)酵培養(yǎng)基中,同樣條件下再培養(yǎng)12 h,為合適收獲時(shí)間。
　　接著,對(duì)海洋芽孢桿菌B-9987中Macrolactins生物合成基因簇進(jìn)行了克隆與生物信息學(xué)分析。研究結(jié)果表明,Macrolactins的骨架是由bmmA-I(bmb1676-1683)編碼的8個(gè)聚酮合酶以丙二酰CoA為延伸單位,經(jīng)11輪克萊森縮合反應(yīng)催化組裝而成,其中bmmA(bmb1676)編碼了反式-?；D(zhuǎn)移酶(trans-AT)。本論文構(gòu)建了用于bmmA雙交