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文檔簡介
1、拓撲異構(gòu)酶是真核生物體內(nèi)最重要的酶之一,調(diào)節(jié)DNA拓撲結(jié)構(gòu),參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、染色體重組以及姐妹染色體分離等多個環(huán)節(jié)。拓撲異構(gòu)酶已經(jīng)成為抗腫瘤藥物的一個重要靶點,靶向拓撲異構(gòu)酶的藥物在臨床上也取得了很好的療效。但拓撲異構(gòu)酶抑制劑在臨床使用過程中出現(xiàn)了許多毒副作用,除了常見的胃腸道反應(yīng),皮膚病,還有許多嚴重的不良反應(yīng)如阿霉素引起的嚴重新心臟毒性、依托泊苷誘發(fā)次生腫瘤(白血?。┮约岸嗨幠退幍取6嗄陙?,開發(fā)高效低毒的拓撲異構(gòu)酶抑制劑一直是
2、抗腫瘤藥物研究的熱點之一。
天然三聯(lián)苯類化合物主要來源于真菌代謝產(chǎn)物,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的三聯(lián)苯類化合物表現(xiàn)出多種生物活性包括抗腫瘤,抗氧化,抗細菌等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)對三聯(lián)苯H1-H8抑制人乳腺導(dǎo)管癌MDA-MB-435細胞增殖,引起細胞G2/M期停滯并誘導(dǎo)細胞凋亡。此外,H1-H8以及從鏈霉菌sp.LZ35中分離得到的對三聯(lián)苯echosidesA-E能不同程度地抑制拓撲異構(gòu)酶的活性,但是這類化合物在對正常細胞和腫瘤細胞的選擇性以
3、及體內(nèi)抗腫瘤活性較差?;谇捌诘难芯炕A(chǔ),本實驗室以對三聯(lián)苯為基本結(jié)構(gòu)進行改造針對拓撲異構(gòu)酶設(shè)計合成了一系列2-苯基萘,本論文研究這一系列2-苯基萘的抗腫瘤活性及其對拓撲異構(gòu)酶的抑制活性,并挑選代表化合物CS1深入研究這類化合物的體內(nèi)外抗腫瘤活性及其抗腫瘤作用機制。
我們首先用SRB法檢測了48個2-苯基萘對三株腫瘤細胞MDA-MB-231,A549和HeLa細胞的細胞毒性,結(jié)果有11個化合物對人乳腺癌MDA-MB-231細胞
4、的IC50小于5μM。然后我們用DNA松弛實驗檢測這11個細胞毒性較強的化合物對拓撲異構(gòu)酶Ⅰ和拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的抑制作用,有5個化合物能完全抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的活性。我們挑選代表化合物1(CS1)深入研究其抗腫瘤作用機制。為研究CS1體外抑制拓撲異構(gòu)酶的作用方式,我們采用了pBR322DNA松弛實驗、kDNA解除鏈接實驗、DNA嵌入實驗以及拓撲異構(gòu)酶介導(dǎo)的DNA斷裂檢測實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CS1是一個DNA非嵌入劑,能夠穩(wěn)定拓撲異構(gòu)酶-DNA可切割
5、三元復(fù)合物,作為一個拓撲異構(gòu)酶Ⅱ毒劑抑制拓撲異構(gòu)酶的活性。為全面評價CS1的體外抗腫瘤作用,我們選取不同組織來源的十一株細胞檢測其細胞毒性,結(jié)果顯示CS1對多種組織來源的腫瘤細胞均表現(xiàn)出一定的細胞毒性,但對正常細胞株HUVEC和HL7702細胞毒性較小。同時我們還檢測了CS1對p-糖蛋白過表達的多藥耐藥細胞株MCF-7/ADR的細胞毒性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CS1對敏感細胞MCF-7和耐藥細胞MCF-7/ADR表現(xiàn)出相同程度的細胞毒性,并且CS1不
6、引起TopoⅡα和TopoⅡβ蛋白降解,這表明CS1具有潛在抗多藥耐藥作用且不易引起耐藥性。周期分析和DNALadder實驗顯示CS1誘導(dǎo)細胞凋亡,我們進一步用AnneixnV/PI雙染色證明CS1誘導(dǎo)細胞凋亡具有一定濃度依賴性。彗星電泳,免疫熒光和免疫印跡等實驗顯示CS1能夠引起DNA斷裂,有趣的是CS1并沒有激活典型的ATM-Chk1/Chk2應(yīng)激反應(yīng),只選擇性磷酸化DNA損傷信號蛋白ATR但對ATM沒有影響。Hoechst3334
7、2染色顯示,CS1誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生多核現(xiàn)象,我們進一步用免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)CS1誘導(dǎo)細胞不正常有絲分裂,形成多個極點,細胞不對稱分裂,誘導(dǎo)細胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)難。最后,我們還有檢測了CS1在裸鼠體內(nèi)對MDA-MB-231腫瘤的抑制作用,結(jié)果顯示CS1給藥15天能顯著抑制腫瘤的生長,按瘤重計算抑制率達62.3%,按腫瘤體積計算抑制率達43.6%,并且CS1對裸鼠體重沒有任何影響。
綜上所述,以CS1為代表的2-苯基萘類化合物具有很強的抗
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