2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:拓撲異構(gòu)酶是一種真核生物生存所必需的核酶,可介導(dǎo)DNA單鏈或雙鏈的瞬時斷裂和再連接,在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組及染色體分離等多個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。根據(jù)其誘導(dǎo)DNA斷裂方式的不同,分為拓撲異構(gòu)酶Ⅰ和拓撲異構(gòu)酶Ⅱ,以拓撲異構(gòu)酶為靶點的抗癌作用成為化療藥物研究的一個重要方向。臨床上許多一抗腫瘤藥物以拓撲異構(gòu)酶為作用靶點,取得了一定臨床療效。但在應(yīng)用過程中仍出現(xiàn)一些問題:多藥耐藥性的產(chǎn)生,因長期使用拓撲異構(gòu)酶毒劑而出現(xiàn)的繼發(fā)性急性髓樣白血病

2、以及心臟毒性。因此,開發(fā)安全,高效,低毒以及可逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的以拓撲異構(gòu)酶為靶點的化療藥物意義重大。RiccardinD是從苔蘚類植物Dumortiera hirsuta分離所得的一種新型的大環(huán)雙聯(lián)卞類化合物。前期研究表明,RiccardinD可以抑制真菌被膜的形成,它的類似物羽苔素E可以逆轉(zhuǎn)真菌耐藥和腫瘤耐藥,另一類似物地錢素C可以通過誘導(dǎo)微管解聚進而導(dǎo)致細胞凋亡最終發(fā)揮抗腫瘤作用,還可將腫瘤細胞阻滯在G2/M期抑制其增殖。本研究是基于

3、前期研究結(jié)果推測RiccardinD可能會具有抗腫瘤及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用。
   方法:⑴選用人慢性骨髓性白血病細胞株K562及人急性粒細胞白血病細胞株HL60,MTT法檢測不同濃度riccardinD對白血病細胞增殖的抑制作用,Hoechst33258,F(xiàn)ITC-AnnexinⅤ雙染法及DNA Ladder檢測riccardinD對白血病細胞凋亡的影響。Western blotting檢測riccardinD對凋亡蛋白Caspa

4、se-3,Caspase-9,cleaved PARP表達的影響。RT-PCR檢測riccardinD對細胞凋亡抑制因子Bcl-2與細胞凋亡促進因子Bax-α比值的影響。最后檢測線粒體和死亡受體介導(dǎo)的兩條凋亡通路中的關(guān)鍵分子Cytochrome c及Caspase-8分析riccardinD可能介導(dǎo)的凋亡通路。⑵以pBR322 DNA為作用底物,etoposide為陽性對照,檢測riccardinD對拓撲異構(gòu)酶Ⅰ和拓撲異構(gòu)酶Ⅱ活性的影響

5、。將riccardinD作用于K562細胞后,提取其拓撲異構(gòu)酶Ⅱ,檢測riccardinD對細胞內(nèi)拓撲異構(gòu)酶Ⅱ活性的影響。實時定量RT-PCR檢測riecardin D對DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱα基因表達的影響。SPR分析進一步檢測riccardinD與拓撲異構(gòu)酶Ⅱα間的結(jié)合能力。選用拓撲異構(gòu)酶Ⅱα缺陷型細胞株HL60/MX2及構(gòu)建拓撲異構(gòu)酶Ⅱα高表達細胞系K562/TopoⅡα檢測riccaxdinD對兩種細胞增殖的影響。⑶體外法,選取非小

6、細胞肺癌細胞H460及A549,采用MIT,Hoechst33258及FITC-AnnexinⅤ雙染法檢測riccardinD對非小細胞肺癌細胞凋亡的影響。另外,劃痕試驗、重組基底膜侵襲與轉(zhuǎn)移及明膠酶活性測定試驗檢測riccardinD對非小細胞肺癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響。體內(nèi)法,以H460細胞接種裸鼠腋下,待腫瘤長至100mm3-300mm3開始尾靜脈注射給予riccardinD,三天一次,給藥三周。給藥結(jié)束后,取瘤組織稱重,計算抑

7、瘤率。取瘤塊進行Western blotting及TUNEL試驗檢測riccardinD體內(nèi)抑瘤作用及對腫瘤組織內(nèi)凋亡蛋白Caspase-3,Caspase-9,cleaved PARP及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2,MMP-9,VEGF及Erk1/2的影響。⑷選用兩株耐藥株K562/A02及H460/RT,分別是阿霉素和紫杉醇耐藥株。采用MTT法檢測riccardinD單用,阿霉素與riccardinD合用,紫杉醇和riccardinD

8、合用后對耐藥細胞的抑制作用,計算合用后藥物逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。以逆轉(zhuǎn)作用較強的紫杉醇和riccardinD合用組進行裸鼠試驗,以H460/RT細胞接種裸鼠腋下,待腫瘤生長至100mm3-300mm3時給予riccardinD和紫杉醇。給藥結(jié)束,取瘤組織稱重,計算抑瘤率。取瘤組織檢測凋亡蛋白及耐藥蛋白表達。另外,檢測riccardinD對K562/A02細胞凋亡蛋白,耐藥蛋白及基因表達水平的影響。
   結(jié)果:①MTT結(jié)果顯示,以ricca

9、rdin D(10μM-60μM)分別與K562,HL60細胞孵育24h,48h,72h,最高抑制率90.6%。Hoechst33258結(jié)果顯示,10μM,20μM和30μM riccardin D明顯誘導(dǎo)細胞凋亡,孵育48h,細胞核染色質(zhì)濃染,固縮或集聚核膜周邊、或呈塊狀碎裂改變。FITC-AnnexinⅤ雙染結(jié)果顯示,10μM riccardinD處理K562細胞24h凋亡率為25.55%,HL60凋亡率為27.56%。DNA La

10、dder結(jié)果顯示,riccardin D處理后產(chǎn)生明顯DNA梯狀片段。Western blot結(jié)果顯示,10μM-40μM riccardin D顯著增加K562和HL60細胞的Caspaso-3,Caspaso-9,cleaved PARP蛋白表達水平。RT-PCR顯示,riccardin D可顯著降低Bcl-2 mRNA水平,增加Bax-α mRNA水平,8cl-2/Bax-α比值明顯降低。此外,10μM-40μMriccardin

11、 D可顯著增加K562細胞內(nèi)Cytochrome c釋放,而對procaspase-8蛋白表達水平無明顯影響。②拓撲異構(gòu)酶活性檢測顯示,riccardin D對拓撲異構(gòu)酶Ⅰ活性無明顯影響,而200μM-800μM riccardin D體外可明顯抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅱ活性,呈現(xiàn)濃度劑量依賴關(guān)系,而且riccardin D對拓撲異構(gòu)酶Ⅱ活性的抑制作用明顯強于陽性對照etoposide。Riccardin D孵育后的K562細胞內(nèi)拓撲異構(gòu)酶Ⅱ活性

12、顯著降低。實時定量RToPCR檢測結(jié)果表明,riccardin D顯著降低K562細胞內(nèi)DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱα mRNA水平。以SPR技術(shù)分析顯示,riccardin D與拓撲異構(gòu)酶Ⅱ高度結(jié)合,結(jié)合常數(shù)KD為2.68E-06。進一步實驗,riccardin D對高表達拓撲異構(gòu)酶Ⅱ細胞抑制作用顯著,而對拓撲異構(gòu)酶Ⅱ缺陷型細胞株HL60/MX2抑制作用較弱,說明riccardin D可能通過靶向拓撲異構(gòu)酶Ⅱ產(chǎn)生抗癌作用。③MTT,Hoechs

13、t33258,F(xiàn)ITC-AnnexinⅤ雙染及Western blot試驗結(jié)果均顯示,riccardin D顯著抑制非小細胞肺癌細胞增殖,促進細胞凋亡及增加凋亡蛋白表達水平。劃痕試驗結(jié)果表明,51μM-10μM riccardin D抑制A549細胞向無細胞劃痕區(qū)遷移。Transwell侵襲試驗顯示,riccardin D抑制A549細胞穿透人工基底膜,當riccardin D濃度為5μM,10μM,20μM時,抑制率分別為40.7%,

14、56.5%,65.4%。明膠酶譜結(jié)果顯示,2.51μM,5μM,10μM riccardin D顯著抑制A549和H460細胞培養(yǎng)液中MMP-2,MMP-9活性。裸鼠移植瘤試驗顯示,riccardinD明顯抑制腫瘤組織生長,20mg/kg時抑制率為44.5%,且裸鼠體重下降不明顯。進一步檢查腫瘤組織,顯示TUNEL陽性染色水平增加,凋亡率為36.9%。④以10μM dccardin D與阿霉素聯(lián)合處理K562/A02可逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥,其

15、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.31。以10μM riccardin D與紫杉醇聯(lián)合處理H460/RT可逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥,逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為8.42。Riccardin D與紫杉醇聯(lián)合處理接種H460/RT的裸鼠,riccardinD,紫杉醇單用組抑瘤率分別為46.8%和48.1%。而riccardin D與紫杉醇合用組腫瘤抑制率為57.3%.與單用組比較,合用組較單用組抑瘤率升高,且凋亡蛋白表達水平明顯升高,而耐藥蛋白表達水平顯著降低。電泳結(jié)果顯示,riccar

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