抗腫瘤藥物4-羥苯基維胺脂低氧耐藥作用機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:4-羥苯基維胺脂(4-HPR;Fenretinide;N-4-hydroxyphenylretinamide)是一個(gè)維甲酸衍生物,在多種腫瘤模型中表現(xiàn)出良好的腫瘤預(yù)防和治療作用。研究表明4-HPR主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。然而在臨床前及臨床研究的低氧環(huán)境下,腫瘤細(xì)胞對(duì)4-HPR產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象,影響了4-HPR的臨床應(yīng)用。低氧是實(shí)體腫瘤中普遍具有的特性之一,在多種生理過(guò)程(細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲等)中發(fā)揮重要作

2、用,可以激活各種信號(hào)通路導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的耐藥。文獻(xiàn)提示4-HPR在較低濃度下可能會(huì)誘發(fā)自噬的產(chǎn)生。在不利于細(xì)胞生存的代謝壓力下,自噬可以通過(guò)降解自身的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器,在細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)態(tài)平衡以保護(hù)細(xì)胞免于發(fā)生凋亡性死亡,因此我們推測(cè)保護(hù)性自噬與4.HPR的低氧耐藥相關(guān).本課題針對(duì)自噬在4-HPR低氧耐藥過(guò)程中所發(fā)揮的作用開(kāi)展研究工作,并對(duì)相關(guān)機(jī)制加以探索。
　　 研究方法:采用磺基羅丹明B(SRB)染色法評(píng)價(jià)4-HPR體外抑制

3、腫瘤細(xì)胞HeLa增殖作用,并分別計(jì)算正常氧壓(20％O2)和低氧(1%O2)下IC50值;采用PI單染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù),考察4-HPR正常氧壓和低氧下促腫瘤細(xì)胞凋亡的能力;應(yīng)用Westernblot檢測(cè)細(xì)胞凋亡及自噬標(biāo)志性蛋白(PARP、LC3)及低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的表達(dá),并對(duì)相關(guān)蛋白條帶進(jìn)行光密度分析;采用吖啶橙染色,在倒置熒光顯微鏡下定性觀察酸性囊泡(AVOs)生成,流式細(xì)胞術(shù)定量分析紅色熒光強(qiáng)度;采用瞬時(shí)RNA干擾技術(shù),通過(guò)沉

4、默自噬相關(guān)基因Beclin1,考察其在4-HPR引起的自噬中的作用;預(yù)孵育抗氧化劑NAC,檢測(cè)活性氧簇(ROS)對(duì)自噬的影響;采用RNA干擾技術(shù)沉默HIF-1α,建立穩(wěn)定敲除HIF-1α的細(xì)胞株,檢測(cè)HIF-1α對(duì)于4-HPR誘導(dǎo)發(fā)生自噬的作用。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.低氧下腫瘤細(xì)胞對(duì)于4-HPR耐藥
　　 正常氧壓下4-HPR作用人官頸癌Hela細(xì)胞的存活率顯著低于低氧下存活率,并呈濃度依賴(lài)性。正常氧壓下

5、,10μM的4-HPR能引起Hela細(xì)胞明顯的凋亡,凋亡率達(dá)到25.80%。低氧環(huán)境中細(xì)胞在相同濃度4-HPR作用下,凋亡率僅有7.69%。正常氧壓下4-HPR對(duì)Hela細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(6.69±1.49)μM,而在低氧下則為(15.69±3.56)μM。
　　 2.4-HPR在低氧下主要引起自噬,而在正常氧壓下引起凋亡
　　 采用Hela細(xì)胞和人卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞,分別檢測(cè)低氧和正常氧壓下4-H

6、PR作用后凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)低氧下LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的增加呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性,正常氧壓下沒(méi)有明顯的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的累積,凋亡標(biāo)志蛋白PARP有明顯切割。
　　 4-HPR(10μM)作用人宮頸癌Hela細(xì)胞24h,吖啶橙染色后,使用流式細(xì)胞儀(BectonDickinson)進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),4-HPR(10μM)作用后,紅色熒光強(qiáng)度從3.45%升高到19.36%,表明4-HPR低氧下可以誘導(dǎo)自噬發(fā)生。而在使用自噬抑

7、制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)預(yù)孵育后加入4-HPR作用的實(shí)驗(yàn)組,紅色熒光強(qiáng)度僅為7.02%,表明白噬的發(fā)生被抑制。4-HPR.(20μM)作用于人卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞24h,吖啶橙染色后,在熒光顯微鏡下觀察到酸性囊泡數(shù)目的增加,而在使用自噬抑制劑3-MA預(yù)孵育后加入4-HPR作用的實(shí)驗(yàn)組,酸性囊泡的增加受到了抑制,說(shuō)明3-MA可以抑制由4-HPR誘導(dǎo)的自噬發(fā)生。
　　 3.低氧下4-HPR誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作

8、用
　　 在Hela細(xì)胞上,將自噬抑制劑3-MA和氯喹(CQ)分別與4-HPR聯(lián)用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CQ/4-HPR或3-MA/4-HPR合用,PARP的切割較4-HPR單用有明顯的增加。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù),檢測(cè)4-HPR在正常氧壓和低氧下引起的細(xì)胞凋亡率。4-HPR單用凋亡率為6.64±0.79%,3-MA單用凋亡率為4.00±0.07%,CQ單用凋亡率為4.95±0.60%,而3-MA/4-HPR合用凋亡率為16.06±0.23%,CQ

9、/4-HPR合用凋亡率為21.39±0.32%,顯示了自噬的抑制會(huì)導(dǎo)致4-HPR介導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡率的增加。正常氧壓下3-MA和CQ不能增加4-HPR誘導(dǎo)凋亡的能力,進(jìn)一步確證正常氧壓下4-HPR主要引起凋亡而非自噬。應(yīng)用SRB檢測(cè)低氧下自噬被抑制后4-HPR的細(xì)胞存活率的變化,發(fā)現(xiàn)低氧下,3-MA顯著地增強(qiáng)了4-HPR對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用,10μM4-HPR單用24h的HeLa細(xì)胞增殖抑制率為41.24±5.61%,2mM3-MA

10、與10μM4-HPR合用的細(xì)胞增殖抑制率為55.97±4.67%(p＜0.05)。
　　 4.Beclin1蛋白參與了4-HPR誘導(dǎo)的自噬
　　 Beclin1蛋白是自噬體形成過(guò)程中所必需的促自噬基因的產(chǎn)物,參與了自噬的起始階段,在HeLa細(xì)胞中沉默Beclin1基因顯著地抑制了低氧4-HPR誘導(dǎo)的自噬。這個(gè)結(jié)果顯示,低氧下4-HPR誘導(dǎo)自噬的發(fā)生需要Beclin1蛋白的參與。在HeLa細(xì)胞中外源性轉(zhuǎn)入Beclin1導(dǎo)致

11、Beclin1蛋白水平的提高時(shí),4-HPR在正常氧壓條件下也能明顯誘導(dǎo)自噬發(fā)生,進(jìn)一步說(shuō)明Beclin1蛋白參與了4-HPR誘導(dǎo)的自噬。
　　 5.低氧下4-HPR誘導(dǎo)自噬不依賴(lài)于活性氧簇
　　 正常氧壓下活性氧簇(ROS)清除劑NAC能顯著減少4-HPR引起的PARP切割,說(shuō)明4-HPR誘導(dǎo)的凋亡被NAC成功逆轉(zhuǎn),提示正常氧壓下4-HPR凋亡誘導(dǎo)作用的發(fā)揮依賴(lài)于ROS。低氧下NAC并不能抑制LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的累積,說(shuō)

12、明低氧下4-HPR誘導(dǎo)自噬是不依賴(lài)于ROS的。
　　 6.HIF-1α介導(dǎo)了低氧下4-HPR誘發(fā)的自噬
　　 與Hela細(xì)胞相比,穩(wěn)定敲除HIF-1α基因的Hela細(xì)胞對(duì)4-HPR(24h)的敏感性明顯增加,4-HPR(10μM)作用下,Hela細(xì)胞的存活率為58.76±5.61%,穩(wěn)定敲除HIF-1α基因的Hela細(xì)胞存活率為27.26±6.61%(p＜0.01)。在穩(wěn)定敲除HIF-1α基因的Hela細(xì)胞中,4-HPR

13、(10μM)能導(dǎo)致明顯的PARP切割片段的產(chǎn)生,卻不能誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生,說(shuō)明HIF-1α蛋白的表達(dá)對(duì)于4-HPR誘發(fā)的自噬是必要的。
　　 結(jié)論:本論文較為系統(tǒng)的研究了在低氧情況下,4-HPR作用于人官頸癌Hela細(xì)胞和人卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞過(guò)程中自噬發(fā)揮的作用,并對(duì)相關(guān)機(jī)制加以探索。研究發(fā)現(xiàn),4-HPR可以誘導(dǎo)保護(hù)性自噬發(fā)生,這種保護(hù)性自噬由HIF-1α介導(dǎo),依賴(lài)于Beclin1的存在,但不通過(guò)活性氧簇(ROS)介導(dǎo)。穩(wěn)定敲