三羥異黃酮對光動力學(xué)療法抗腫瘤治療的增效作用及機制研究.pdf

1、目的：光動力學(xué)療法(photodynamictherapy，PDT)已經(jīng)成為一種有效的抗腫瘤治療方法，但是現(xiàn)有PDT所用照射光對組織的穿透深度有限，使深部腫瘤組織受到的PDT作用強度顯著減弱，影響了PDT對深部腫瘤的作用效果并限制了其進(jìn)一步臨床應(yīng)用。同時，PDT不僅能通過激活腫瘤細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)系統(tǒng)或PDT的直接光毒性作用抑制腫瘤的增殖；亞致死劑量PDT作用還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞存活相關(guān)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生逃避反應(yīng)，并可能使腫

2、瘤細(xì)胞逃避打擊。因而深入研究PDT作用機制及其量效作用特點，抑制腫瘤細(xì)胞的逃避反應(yīng)并增強PDT作用效果是重要的臨床研究課題。本研究將血卟啉衍生物(hematoporphyrinderivativ，HpD)介導(dǎo)的光動力學(xué)療法與小劑量酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase，PTK)抑制劑三羥異黃酮(genistein，GEN)協(xié)同應(yīng)用，觀察其對腫瘤抑制的增強作用；并觀察不同強度PDT作用對腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化與去磷酸化動態(tài)平

3、衡、缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-induciblefactor1，HIF-1)及其靶基因血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)表達(dá)的影響以及GEN的干預(yù)作用，為深入了解PDT的作用機制及量效作用特點，探索PDT臨床治療方案提供實驗依據(jù)。 方法：本實驗研究以小鼠肝癌細(xì)胞株H22為研究對象，以MTT法檢測不同強度PDT及不同劑量GEN單獨或協(xié)同作用對H22細(xì)胞的增殖抑制作

4、用；分別以同位素檢測、吸光度檢測、westernblot、EMSA和RT-PCR等實驗方法，觀察不同強度PDT直接作用后H22細(xì)胞蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase，PTK)活性、蛋白酪氨酸磷酸酶(proteintyrosinephosphatase，PTP)活性、細(xì)胞HIF-1α蛋白含量、胞核HIF-1DNA結(jié)合活性、VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄水平的改變及量效特點，以及GEN干預(yù)后上述檢測指標(biāo)的變化；建立H22細(xì)胞荷

5、瘤小鼠體內(nèi)實驗動物模型，觀察PDT及GEN單獨或協(xié)同應(yīng)用對荷瘤小鼠腫瘤體積及生存時間的影響，以免疫組化法檢測PDT作用對小鼠腫瘤組織HIF-1蛋白、VEGF蛋白及新生微血管密度(MVD)表達(dá)的影響，以及GEN的干預(yù)作用。 結(jié)果：1.在體外實驗中，當(dāng)HpD濃度為5μg/ml，光照能量密度在0.25J/cm2至8J/cm2范圍時，PDT可以顯著抑制H22細(xì)胞的增殖，抑制程度與光能量密度相關(guān)，半數(shù)抑制劑量(IC50)為1.9957J/

6、cm2。 2.10-8mol/L的GEN單獨作用雖不能抑制H22細(xì)胞的增殖，但能顯著增強PDT對H22細(xì)胞的增殖抑制作用，其中在小劑量PDT作用時(小于IC50)，GEN的增效作用非常顯著。 3.當(dāng)HpD濃度為5μg/ml，光照能量密度大于0.5J/cm2，PDT作用強度大于IC30時，PDT作用對H22細(xì)胞PTK、PTP活性均顯著抑制，同時PTK/PTP活性比值呈劑量依賴性下降；光照能量密度小于0.5J/cm2，PDT

7、作用強度小于IC30時，PDT作用主要表現(xiàn)為對H22細(xì)胞PTP活性的抑制，PTK/PTP活性比值相對升高。 4.10-8mol/L的GEN能夠顯著降低不同強度PDT作用后H22細(xì)胞PTK活性，提高PTP相對活性，顯著降低PTK/PTP活性比值。 5.當(dāng)HpD濃度為5μg/ml，光照能量密度大于0.5J/cm2，PDT作用強度大于IC30時，PDT作用呈劑量依賴性的抑制H22細(xì)胞HIF-1α蛋白水平、HIF-1結(jié)合活性及V

8、EGFmRNA表達(dá)；光照能量密度小于0.5J/cm2，PDT作用強度小于IC30時，PDT作用可以導(dǎo)致H22細(xì)胞HIF-1α蛋白水平、HIF-1結(jié)合活性及VEGFmRNA表達(dá)升高；PDT對腫瘤細(xì)胞的不同量效影響作用隨時間延長有顯著減弱。 6.10-8mol/L的GEN能夠顯著降低不同強度PDT作用后H22細(xì)胞HIF-1α蛋白水平、HIF-1結(jié)合活性及VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。 7.在體內(nèi)實驗中，在10mg/kg的Hp

9、D介導(dǎo)下，200J/cm2治療劑量的PDT作用后，腫瘤組織HIF-1α及VEGF蛋白表達(dá)水平較對照組升高；GEN的協(xié)同使用能顯著降低PDT作用后腫瘤組織的HIF-1α、VEGF蛋白水平及新生微血管密度(MVD)。 8.GEN與PDT的聯(lián)合應(yīng)用能較PDT或GEN的單獨作用更為顯著的延緩荷瘤小鼠腫瘤體積的增長并延長荷瘤小鼠的生存時間。 結(jié)論：1.在體外及體內(nèi)實驗中，HpD介導(dǎo)PDT與小劑量酪氨酸激酶抑制劑GEN的聯(lián)合應(yīng)用能較

10、PDT或GEN的單獨作用更為顯著的抑制腫瘤增殖，小劑量GEN能顯著增強HpD介導(dǎo)PDT的抗腫瘤作用療效。 2.在體外實驗中，HpD介導(dǎo)PDT的直接作用對H22細(xì)胞蛋白酪氨酸激酶、磷酸酶活性及HIF-1相關(guān)信號傳導(dǎo)途徑有重要的調(diào)節(jié)作用并有顯著的量效關(guān)系：大于0.5J/cm2劑量的PDT作用能夠呈劑量依賴性的降低H22細(xì)胞PTK/PTP活性比值、HIF-1α蛋白含量、HIF-1DNA結(jié)合活性、VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)；而小于0.5J

11、/cm2劑量的PDT作用可導(dǎo)致H22細(xì)胞PTK/PTP活性比值、HIF-1α蛋白含量、HIF-1DNA結(jié)合活性、VEGFmRNA含量升高。 3.在體外實驗中，小劑量GEN可同時干預(yù)不同強度PDT作用后H22細(xì)胞PTK和PTP活性，降低PTK/PTP活性比值，促進(jìn)HIF-1α蛋白降解，抑制HIF-1活化及VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄。 4.在體內(nèi)實驗中，小劑量GEN能顯著降低HpD介導(dǎo)PDT作用后腫瘤組織的HIF-1α、VEGF蛋