Telekin抗腫瘤多藥耐藥作用及機制研究.pdf

1、全球癌癥發(fā)病率居高不下，癌癥作為一種惡性疾病嚴(yán)重威脅著人類健康。作為如今腫瘤的主要治療方法之一的化療法，其治療效果受到腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥作用的限制。因此，開發(fā)抗癌活性高，并且能夠抗癌細(xì)胞多藥耐藥的抗腫瘤藥物成為了抗腫瘤藥物的研究熱點。本課題針對Telekin的抗腫瘤多藥耐藥作用及其機制展開相關(guān)研究工作，所用到的研究對象-化合物Telekin是從天然植物金挖耳中提取的一種桉烷內(nèi)酯類化合物，在前期實驗中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗腫瘤活性?；谇?/p>

2、期Telekin抗腫瘤機制的研究結(jié)果，本論文發(fā)現(xiàn)其對多藥耐藥的癌細(xì)胞也有抑制作用并進一步展開機制探討工作。
　　我們選取了三組耐藥及其親本細(xì)胞株K562、K562/A02，KB、KB/VCR,MCF-7、MCF-7/ADR進行藥物敏感性篩選。MTT結(jié)果顯示，Telekin對于多藥耐藥細(xì)胞具有直接的較強毒性，與傳統(tǒng)化療藥物長春新堿，阿霉素等相比具有不受耐藥泵影響的優(yōu)勢，且對K562/A02及K562細(xì)胞的藥物敏感性高于其他兩對組織來

3、源的細(xì)胞株，對K562/A02及K562的細(xì)胞增殖抑制作用呈現(xiàn)出時間及濃度的依賴性。采用Annexin V/PI雙染法以及DAPI染色對經(jīng)Telekin處理48h后的K562/A02及K562細(xì)胞進行調(diào)亡檢測。結(jié)果顯示，Telekin對K562/A02及K562具有都誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的作用，Western Blot對凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族以及Caspase家族蛋白的表達量進行檢測后，我們發(fā)現(xiàn)在Telekin的作用下，K562/A02細(xì)胞

4、中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量降低，凋亡促進蛋白Bax表達量升高;未活化的Caspase-9和Caspase-3蛋白的表達量降低，同時其活化形式的CleavedCaspase-9和Cleaved Caspase-3的表達量明顯增加，并呈現(xiàn)出濃度依賴性。以上結(jié)果表明，Telekin可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族及Caspase家族蛋白表達，誘導(dǎo) K562/A02細(xì)胞凋亡。
　　在后續(xù)實驗中，我們主要對Telekin抗多藥耐藥的作用機制進

5、行相關(guān)研究。由于P-gp泵對藥物的外排被認(rèn)為是引起腫瘤細(xì)胞多藥耐藥作用的主要因素之一。我們首先采用Rh123及阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的累積實驗對Telekin處理的K562/A02細(xì)胞中的P-gp進行探究。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果說明，經(jīng)非毒性劑量Telekin處理的K562/A02細(xì)胞內(nèi)的Rh123及阿霉素積累量無明顯增加，Telekin(10μmol/L，20μmol/L)處理的K562/A02細(xì)胞內(nèi)Rh123及阿霉素累積量有明顯增加。由此，我們

6、推測，Telekin可能不是通過增加化療藥物的細(xì)胞內(nèi)含量，而是直接誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡，由于在毒性劑量下Telekin抑制耐藥細(xì)胞中P-gp蛋白的表達，從而引起P-gp泵功能的下調(diào)。進而，我們對Telekin抑制P-gp轉(zhuǎn)錄和蛋白表達做進一步的探討。我們用流式細(xì)胞儀，Western Blot及實時定量PCR對P-gp蛋白表達量進行檢測，實驗結(jié)果表明經(jīng)不同濃度Telekin處理的K562/A02細(xì)胞中P-gp的蛋白表達及轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低，且

7、呈現(xiàn)出濃度依賴性。
　　我們也針對Telekin對另外兩種與多藥耐藥相關(guān)的蛋白MRP-1以及ABCG2的影響進行了探究。由于ABCG2在乳腺癌耐藥細(xì)胞株中呈現(xiàn)高表達，故我們選用人乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/A及其親本細(xì)胞株MCF-7，針對Telekin對細(xì)胞中ABCG2的作用進行研究。流式細(xì)胞儀和實時定量PCR結(jié)果顯示，Telekin能夠抑制K562/A02細(xì)胞中MRP-1蛋白的表達量以及其轉(zhuǎn)錄水平的表達，并呈現(xiàn)濃度依賴性。米托蒽

8、醌累積實驗結(jié)果表明，經(jīng)高濃度(20μmol/L)Telekin處理的MCF-7/A細(xì)胞內(nèi)米托蒽醌的累積量顯著增加，并呈現(xiàn)出濃度依賴性。我們進一步對ABCG2蛋白的表達進行檢測。Western Blot以及RT-PCR實驗結(jié)果表明，經(jīng)不同濃度Telekin處理的MCF-7/A細(xì)胞中ABCG2的蛋白表達及轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。綜合實驗結(jié)果，我們推測，Telekin也抑制耐藥細(xì)胞中MRP-1及ABCG2蛋白水平及轉(zhuǎn)錄水平的表

9、達。
　　由于P-gp的編碼基因MDR1啟動子核心區(qū)域存在能夠與NF-κB相結(jié)合的特異性區(qū)域，ABCG2的啟動子能夠與NF-κB的p50亞基結(jié)合。NF-κB通路的活化能夠上調(diào)P-gp及ABCG2蛋白的表達，最終引起腫瘤細(xì)胞多藥耐藥作用，故我們主要針對AKT/NF-κB信號通路對P-gp及ABCG2蛋白表達的調(diào)控進行了進一步探究。Western Blot檢測結(jié)果表明，在Telekin處理的K562/A02及MCF-7/A細(xì)胞中pho

10、spho-AKT與NF-κ3表達量明顯降低，Ⅰ-κB的表達量升高。Telekin能夠通過調(diào)節(jié)AKT/NF-κB信號通路，并且對其細(xì)胞中高表達的多藥耐藥作用相關(guān)蛋白P-gp、ABCG2的表達具有抑制作用。
　　綜上所述，Telekin能夠繞過多藥耐藥細(xì)胞中P-gp耐藥泵的作用，并下調(diào)多種多藥耐藥泵的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達直接誘導(dǎo)多藥耐藥細(xì)胞凋亡，是一個具有發(fā)展?jié)摿Φ目鼓[瘤多藥耐藥的天然產(chǎn)物，我們的研究也為其今后的進一步開發(fā)與臨床應(yīng)用提供了有