鹽酸千金藤堿逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的作用及其機(jī)制.pdf

1、目前，臨床腫瘤的化學(xué)治療仍然是主要的治療方法之一。但隨著化療藥物的大量應(yīng)用，臨床腫瘤患者產(chǎn)生多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)越加嚴(yán)重，直接影響臨床腫瘤病人的治療效果，其中多藥耐藥基因MDR1編碼的P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）過度表達(dá)是MDR的重要機(jī)制之一。鑒于此，尋找腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)劑，提高腫瘤對化療的敏感性，是醫(yī)藥學(xué)界當(dāng)前亟待解決的問題。國內(nèi)外雖然發(fā)現(xiàn)了一些逆轉(zhuǎn)MDR的化合物，一部分已

2、經(jīng)進(jìn)入了Ⅰ/Ⅱ期臨床研究，但多數(shù)都由于毒副作用較大，限制了其臨床應(yīng)用。因此，研發(fā)低毒、高效的逆轉(zhuǎn)MDR藥物尤為重要。
　　 鹽酸千金藤堿(cepharanthine hydrochloride，CH)是從千金藤屬植物中提取分離的一種單體化合物，經(jīng)半合成而獲得。本課題組前期研究證實CH逆轉(zhuǎn)MDR涉及多種機(jī)制。但國內(nèi)外尚無CH調(diào)控JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其體內(nèi)逆轉(zhuǎn)MDR作用的研究，本課題將對此進(jìn)行研究，共分三部分:第一部分是在轉(zhuǎn)錄水平和

3、蛋白水平研究CH對P-gp表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控的機(jī)制，為CH進(jìn)一步開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。第二部分旨在通過檢測CH給藥前后荷耐藥腫瘤小鼠外周血CD8+細(xì)胞中P-gp活性的變化，探討一種在動物模型中評價以P-gp為靶點的耐藥逆轉(zhuǎn)劑效果的方法，并考察CH在體內(nèi)的腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)作用，從而為CH或者其他潛在的MDR逆轉(zhuǎn)劑的研究提供科學(xué)依據(jù)。第三部分首先分析非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)化療

4、不敏感患者外周血CD56+細(xì)胞中P-gp的表達(dá)和功能變化，探討CD56+細(xì)胞作為預(yù)測多藥耐藥指標(biāo)的可能性，為臨床提供一種檢測NSCLC化療耐藥的簡便方法，然后通過檢測CH對外周血CD56+細(xì)胞P-gp功能的抑制作用，間接評價其對體內(nèi)腫瘤細(xì)胞P-gp的抑制作用，為CH進(jìn)一步應(yīng)用到臨床提供科學(xué)依據(jù)，同時探討一種以臨床腫瘤患者外周血CD56+細(xì)胞為替代分析指標(biāo)，對P-gp抑制劑的逆轉(zhuǎn)效果進(jìn)行評價的方法。
　　 第一部分鹽酸千金藤堿逆轉(zhuǎn)

5、腫瘤多藥耐藥性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究
　　 目的:
　　 JNK信號通路與腫瘤MDR的發(fā)生及調(diào)控MDR1基因的表達(dá)具有密切關(guān)系。本研究的目的是觀察鹽酸千金藤堿在人慢性粒性白血病K562耐多柔比星細(xì)胞株K562/ADR中，逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法:
　　 采用Western blot和RT-PCR法分別檢測CH單用及與JNK抑制劑SP600125合用后，耐藥性K562/ADR細(xì)胞中P-gp及M

6、DR1 mRNA表達(dá)的變化，考察CH對JNK通路的調(diào)控;采用Western blot法檢測CH對轉(zhuǎn)錄因子c-Jun蛋白表達(dá)和磷酸化的影響，考察CH對c-Jun和磷酸化c-Jun的調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、隨著CH濃度的增加(5.0、10.0、20.0μM)，對MDR1 mRNA的抑制作用逐漸增強(qiáng);隨著CH(10.0μM)作用時間的延長（0、12、24、36和48 h），對P-gp及MDR1 mRNA的抑制作用逐

7、漸增強(qiáng);
　　 2、CH聯(lián)合JNK抑制劑SP600125后，CH對P-gp及MDR1 mRNA的抑制作用減弱;
　　 3、隨著CH(10.0μM)作用時間的延長(0、6、12、24 h)，轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的表達(dá)和磷酸化逐漸增加。
　　 小結(jié):
　　 CH能夠時間和濃度依賴性地下調(diào)MDR1 mRNA的表達(dá)，并能夠時間依賴性地下調(diào)P-gp的表達(dá)，其機(jī)制可能是活化JNK/c-Jun。
　　 第二部分鹽

8、酸千金藤堿逆轉(zhuǎn)動物體內(nèi)腫瘤多藥耐藥性的實驗研究
　　 目的:
　　 本研究旨在通過檢測CH給藥前后荷耐藥腫瘤小鼠外周血CD8+細(xì)胞中P-gp活性的變化，以及CH聯(lián)合臨床FAP化療方案對耐藥性腫瘤生長的抑制作用，評價CH逆轉(zhuǎn)體內(nèi)腫瘤MDR的作用，探討一種在動物模型中評價以P-gp為靶點的MDR逆轉(zhuǎn)劑療效的方法，從而為CH或者其他MDR逆轉(zhuǎn)劑的研究提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法:
　　 采用小鼠肝癌多藥耐藥細(xì)胞株

9、Hca/FAP通過腋下接種建立耐藥實體型腫瘤動物模型，在該模型中研究CH在體外、體內(nèi)干預(yù)后外周血CD8+細(xì)胞P-gp功能的變化。利用CD8+細(xì)胞中的羅丹明123(Rho123)蓄積作為一個替代分析指標(biāo)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD8+細(xì)胞內(nèi)Rho123的平均熒光強(qiáng)度(MFI)，其變化反映P-gp功能的改變。
　　 結(jié)果:
　　 1、給小鼠尾靜脈注射0.5、1.0、2.5、5.0、7.5 mg/kg的Rho123劑量后，外周血C

10、D8+細(xì)胞中的MFI分別為2.6±0.3、3.9±0.4、8.6±0.4、16.4±0.5、21.9±0.5，呈劑量依賴性變化;
　　 2、體外全血中，不同濃度CH(10.0、5.0、2.5μM)或維拉帕米(VER)5.0μM或生理鹽水(NS)均分別合用0.5μg/mL Rho123后全血中CD8+細(xì)胞中的MFI依次為29.8±0.9、25.4±1.0、22.9±0.5、20.0±0.3、14.4±0.3，經(jīng)統(tǒng)計差異具有顯著性(

11、P＜0.05)，CH濃度依賴性地增加Rho123的蓄積;
　　 3、給荷Hca/FAP腫瘤的小鼠尾靜脈注射不同劑量CH(10.0、5.0、2.5 mg/kg)或VER5.0 mg/kg或NS，均分別聯(lián)合注射2.5 mg/kg Rho123后外周血CD8+細(xì)胞中的MFI依次為18.9±0.8、13.1±0.8、11.9±0.4、10.2±0.2、8.6±0.1，經(jīng)統(tǒng)計各組之間差異具有顯著性（P＜0.05），CH劑量依賴性地增加Rh

12、o123的蓄積;
　　 4、不同濃度的CH(10.0、5.0、2.5 mg/kg)聯(lián)合FAP化療方案對Hca/FAP荷瘤小鼠的腫瘤生長有不同程度的抑制作用，與FAP組相比，聯(lián)用CH組的抑瘤作用增強(qiáng)，且抑瘤作用與CH呈劑量依賴性，10.0 mg/kg CH聯(lián)合FAP化療組的抑瘤作用最強(qiáng)。
　　 小結(jié):
　　 CH在體內(nèi)對腫瘤MDR有逆轉(zhuǎn)作用，CH在體內(nèi)對CD8+細(xì)胞P-gp功能的抑制作用可能反映了其對體內(nèi)腫瘤耐藥細(xì)

13、胞P-gp的抑制，小鼠外周血CD8+細(xì)胞可以作為評價潛在P-gp抑制劑體內(nèi)逆轉(zhuǎn)作用的一個替代分析指標(biāo)。
　　 第三部分鹽酸千金藤堿對人外周血CD56+細(xì)胞中P糖蛋白功能的調(diào)節(jié)及CD56與腫瘤耐藥的相關(guān)性研究
　　 目的:
　　 本研究通過分析非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)化療不敏感患者外周血CD56+細(xì)胞中P-gp的表達(dá)和功能變化，探討CD56+細(xì)胞作為預(yù)測多藥耐藥指標(biāo)的可能性，為臨床提供一種檢測腫瘤化療耐藥的簡便方

14、法，并以此為基礎(chǔ)，研究CH對CD56+細(xì)胞中P-gp的抑制作用，間接評價其對體內(nèi)腫瘤細(xì)胞P-gp的抑制作用，為CH將來作為MDR逆轉(zhuǎn)劑進(jìn)行臨床療效評價奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 選臨床27例對化療不敏感的NSCLC患者及31例初始化療的NSCLC患者，并設(shè)正常對照組，分別抽取外周血，采用磁珠分選分離純化CD56+細(xì)胞，采用熒光定量PCR方法檢測各組CD56+細(xì)胞中MDR1、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(MRP1)mRNA的變化

15、;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD56+細(xì)胞在CH體外干預(yù)下P-gp功能的變化，其功能變化通過Rho123在細(xì)胞內(nèi)MFI的變化表示。
　　 結(jié)果:
　　 1、化療不敏感患者27例與正常對照組相比，前者外周血CD56+細(xì)胞中MDR1mRNA表達(dá)顯著增高（2-10倍），MRP1 mRNA表達(dá)增加1-3倍（平均約2倍），經(jīng)統(tǒng)計均具有顯著性差異（P＜0.05）;而MDR1和MRP1 mRNA在化療初始對照組與正常對照組之間無顯著性差異(P

16、＞0.05);
　　 2、化療不敏感組、化療初始對照組和正常對照組外周血CD56+細(xì)胞中Rho123的熒光強(qiáng)度分別為15.1±2.1、20.8±2.6和21.0±2.5，與化療初始對照組31例和正常對照組相比，化療不敏感組患者外周血CD56+細(xì)胞中P-gp的功能增加具有顯著性(P＜0.05)，而化療初始對照組與正常對照組之間無顯著性差異;
　　 3、化療不敏感患者外周血CD56+細(xì)胞的P-gp功能在CH干預(yù)下，隨著CH濃

17、度的增加逐步恢復(fù)到正常水平，而化療初始對照組患者外周血CD56+細(xì)胞的P-gp功能在CH干預(yù)下與正常對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 小結(jié):
　　 1、NSCLC化療不敏感患者外周血CD56+細(xì)胞中MDR1 mRNA表達(dá)和P-gp功能均明顯增強(qiáng)，提示CD56+細(xì)胞可能是診斷NSCLC化療耐藥的一個重要生物標(biāo)志物，MRP1 mRNA在NSCLC化療不敏感患者外周血CD56+細(xì)胞中表達(dá)較低，以上結(jié)果為臨床NSCLC

18、耐藥的診斷提供了一個簡單可行的方法;
　　 2、CH在體外人外周血中對CD56+細(xì)胞中P-gp功能的調(diào)節(jié)可能能夠充分反映其對體內(nèi)腫瘤細(xì)胞中P-gp的調(diào)節(jié)作用，這為潛在P-gp抑制劑的臨床療效評價提供了一個科學(xué)、可行的方法，但仍需要進(jìn)一步的臨床試驗研究。
　　 全文總結(jié):
　　 1.CH通過活化JNK/c-Jun而調(diào)節(jié)MDR1 mRNA和P-gp的表達(dá)，發(fā)揮其逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的作用。
　　 2.耐藥性實體型動

19、物腫瘤模型結(jié)合小鼠外周血CD8+細(xì)胞中P-gp功能檢測可作為P-gp抑制劑體內(nèi)腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)活性評價的一個方法，CH通過抑制P-gp的功能而發(fā)揮其體內(nèi)腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用。
　　 3.NSCLC化療不敏感患者外周血CD56+細(xì)胞中P-gp的表達(dá)和功能檢測可作為診斷肺癌化療耐藥性的一個重要方法;CH在體外全血中對CD56+細(xì)胞中P-gp功能的調(diào)節(jié)可能能夠充分反映其對體內(nèi)腫瘤細(xì)胞中P-gp的調(diào)節(jié)作用，這為臨床腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)劑的療效評價