鹽酸千金藤堿(CH)逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥性與P-gp ATP酶活性的關(guān)系研究.pdf

1、背景和目的:
　　 肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種高發(fā)性腫瘤,其發(fā)病率在全世界位列第五,而在腫瘤導(dǎo)致的死亡中位列第三[1-2]。在北美和西歐一些國家中,每100000人中大約有10人會因?yàn)榛加懈伟┒鴮?dǎo)致死亡,而在亞洲和非洲一些國家中,每100000人中會有50-150因此而死亡[3]。盡管在過去的50年中,對肝癌的治療大有改進(jìn),但肝癌細(xì)胞容易對一些化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥(multidru

2、g resistance,MDR)而導(dǎo)致治療效果一直不佳[4-8]。MDR是指腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生抗藥性的同時(shí)對其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉抗藥性[9-10]。其中產(chǎn)生多藥耐藥的一個(gè)很重要原因是P-糖蛋白(P—glycoprotein,P—gp)的過度表達(dá)。P—gp是膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)超家族成員之一,定位于細(xì)胞膜。Loo TW等[11-12]等發(fā)現(xiàn)P—gp由兩個(gè)相似的部分組成,每一部分都有六個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)核苷酸結(jié)合域。另

3、外,Loo TW等通過對P—gp二硫鍵的分析,發(fā)現(xiàn)近其質(zhì)膜側(cè)的第六跨膜區(qū)和第八跨膜區(qū)具有膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能,據(jù)此認(rèn)為P—gp具有通道蛋白性質(zhì)。Kimura Y等[13]發(fā)現(xiàn)在真核生物中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子(ATP-bindingcassette transporter)具有運(yùn)輸調(diào)節(jié)通道功能,而P—gp是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子超家族中最主要的成員,P—gp主要通過ATP的水解而實(shí)現(xiàn)其運(yùn)輸功能。許多文獻(xiàn)都報(bào)道了P—gp是介導(dǎo)腫瘤耐藥的重要因素,在許多腫瘤耐藥細(xì)胞中,

4、如肝癌耐藥細(xì)胞、肺癌耐藥細(xì)胞、乳腺癌耐藥細(xì)胞、白血病耐藥細(xì)胞等,均可檢測到P—gp的高表達(dá),其介導(dǎo)腫瘤耐藥的機(jī)制主要為P—gp能夠識別抗腫瘤藥物,并且利用ATP產(chǎn)能,把抗腫瘤藥物從細(xì)胞內(nèi)不斷地泵出到細(xì)胞外,從而使抗腫瘤藥物在細(xì)胞內(nèi)不能達(dá)到所期待的濃度,降低藥物的療效。
　　 為克服MDR需尋找有效的逆轉(zhuǎn)劑,有相關(guān)文獻(xiàn)表明一些逆轉(zhuǎn)劑如維拉帕米和環(huán)孢素A等可逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥,但這些藥物應(yīng)用于體內(nèi)會產(chǎn)生很大的毒性從而限制其臨床應(yīng)用。鹽酸千

5、金藤堿(cepharanthine hydrochloride,CH)是從防已科千金藤屬植物的塊莖中提取分離出來的一種雙芐基異喹啉類生物堿單體化合物千金藤[14]與鹽酸成鹽而得,具有多種生物學(xué)活性。目前,有文獻(xiàn)表明其具有體外逆轉(zhuǎn)多柔比星等一些抗腫瘤藥物產(chǎn)生的耐藥性,但對于逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥的體內(nèi)研究,比較少見,尤其從P—gp ATP酶活性方面來研究其機(jī)制的文獻(xiàn)更是少見。在臨床上,有觀察發(fā)現(xiàn),肝癌患者更易對多柔比星(adriamycin,A

6、DR)、順鉑(cis—dichlorodiamineplatinum,CDDP)、5-氟尿嘧啶(5-flurouracil,5-FU)產(chǎn)生耐藥,本課題在模擬臨床FAP(ADR+CDDP+5-FU)方案[15-16]建立BALB／c小鼠肝癌多藥耐藥模型基礎(chǔ)上[17],研究CH聯(lián)合FAP對P—gp ATP酶活性的影響,從而進(jìn)一步探討CH聯(lián)合FAP對肝癌多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制。
　　 材料與方法:
　　 在建立BALB／c

7、小鼠肝癌多藥耐藥的模型基礎(chǔ)上,應(yīng)用MTT法測定CH和維拉帕米對H22／FAP耐藥細(xì)胞的無毒劑量；MTT法測定肝癌H22／FAP細(xì)胞對多柔比星(adriamycin,ADR),順鉑(cis-dichlorodiamineplatinum,CDDP),和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)的耐藥性,并計(jì)算其耐藥倍數(shù)(resistance index,RI)；觀察用藥后BALB／c小鼠的生存時(shí)間,并計(jì)算小鼠生命延長率,評價(jià)C

8、H聯(lián)合FAP對肝癌多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用；試驗(yàn)用雌性BALB／c小鼠腹腔接種H22／FAP肝癌細(xì)胞(每只0.2ml,1×105個(gè)細(xì)胞／ml),隨機(jī)分組,尾靜脈給藥,連續(xù)用藥7天后,按參考文獻(xiàn)法制備質(zhì)膜；用考馬斯亮藍(lán)法取20ug上述步驟中的質(zhì)膜,并用定磷法檢測P—gp ATP酶的活性；
　　 結(jié)果:
　　 1、MTT法檢測CH與VER對H22／FAP的無毒劑量(抑制率<10％):結(jié)果顯示,CH和VER劑量分別為1.0mg／ml

9、,0.15mg／ml時(shí),對H22／FAP細(xì)胞的抑制率<10％；
　　 2、用MTT法檢測ADR,CDDP,和5-FU對H22肝癌細(xì)胞的IC50分別為:0.12±0.01,0.10±0.02,6.36±0.23; ADR,CDDP,和5-FU對H22／FAP肝癌多藥耐藥細(xì)胞的IC50分別為:3.33±0.07,1.02±0.21,71.23±0.24；H22／FAP肝癌多藥耐藥細(xì)胞對ADR,CDDP,和5-FU的耐藥倍數(shù)分別為27

10、.75,10.20,11.20,證實(shí)實(shí)驗(yàn)所用的H22／FAP細(xì)胞為一多藥耐藥細(xì)胞。
　　 3、對小鼠生命延長率的評價(jià)發(fā)現(xiàn):CH10mg／kg,CH5mg／kg,VER1.25mg／kg組均可明顯延長H22／FAP MDR小鼠的生存時(shí)間,生存天數(shù)分別為29.46±2.33,31.08±2.42,29.21±1.47,與單純用化療約的FAP組(20.89±1.21)對比,對小鼠的生命延長率分別為40.1％,48.8％,39.8％,有

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05):
　　 4、通過對體內(nèi)P-gp ATP酶活性的檢測發(fā)現(xiàn),CH聯(lián)合FAP能有效提高基礎(chǔ)ATP酶活性,Km大約為為1.11mg／kg,Vmax大約為184nmol／(min·mg).
　　 結(jié)論:
　　 1、通過對小鼠生命延長率的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CH聯(lián)合FAP能明顯延長BALB／c小鼠生存時(shí)間,逆轉(zhuǎn)H22／FAP肝癌細(xì)胞的耐藥；
　　 2、CH逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制之一可能為通過提高P—gp A