Thiocoraline的抗腫瘤活性及其耐藥機(jī)制研究.pdf

1、不良的藥代動(dòng)力學(xué)特征，藥物的毒副作用，特別是藥物耐藥性的出現(xiàn)，使化療藥物在臨床腫瘤治療中的效果大幅降低。而海洋復(fù)雜多變的生存環(huán)境，賦予了生活在其中的生物特殊的抵御手段，這些化學(xué)或者生物適應(yīng)產(chǎn)生了許多具有特殊生物活性和潛在抗腫瘤效應(yīng)的化合物。Thiocoraline即噻可拉林，為含硫縮肽，是一種DNA雙嵌插劑，最初是從海洋單胞菌Micromonospora marina中分離得到，在抗癌活性方面有很好的效果。
　　本課題以thioc

2、oraline為研究對(duì)象，研究thiocoraline抗腫瘤活性及乳腺癌對(duì)thiocoraline產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制。使用MTT法檢測(cè)thiocoraline對(duì)MCF-7細(xì)胞，L-02細(xì)胞的毒性作用;利用MTT法和結(jié)晶紫染色比較thiocoraline和doxorubicin對(duì)MCF-7細(xì)胞的作用效果;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)thiocoraline對(duì)細(xì)胞周期的影響;Hoechst33342和Western Blot檢測(cè)thiocoraline誘

3、導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況;通過濃度梯度遞增法培養(yǎng)得到對(duì)thiocoraline耐藥的MCF-7/T細(xì)胞株，并確定其耐藥指數(shù)。利用生長(zhǎng)曲線和克隆形成實(shí)驗(yàn)比較MFC-7細(xì)胞與MCF-7/T耐藥細(xì)胞的生物學(xué)特征。通過半定量PCR初步篩選出與thiocoraline相關(guān)的耐藥靶點(diǎn);qPCR，Western Blot進(jìn)一步分析比較耐藥細(xì)胞MCF-7/T與MCF-7細(xì)胞之間的差異。針對(duì)Akt位點(diǎn)，用慢病毒構(gòu)建的MCF-7/Akt1細(xì)胞株和Akt磷酸化抑制劑M

4、K-2206HCl，通過MTT法及Western Blot實(shí)驗(yàn)深入研究thiocoraline引起MCF-7耐藥的分子機(jī)制。利用MK-2206HCl抑制MCF-7/T耐藥細(xì)胞中Akt蛋白的磷酸化，通過MTT法檢測(cè)其逆轉(zhuǎn)MCF-7/T耐藥細(xì)胞對(duì)thiocoraline耐藥性的作用效果。
　　MTT法和結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明thiocoraline對(duì)MCF-7細(xì)胞具有顯著的殺傷活性，在納摩爾級(jí)的濃度下即可發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。肝正常細(xì)胞L-02

5、對(duì)thiocoraline不敏感，當(dāng)thiocoraline濃度為100nmol/L時(shí)，L-02細(xì)胞的成活率為69.43±13.48％。Thiocoraline對(duì)MCF-7細(xì)胞48h的IC50值為53.8±2.53nmol/L，與doxorubicin相比，對(duì)腫瘤細(xì)胞有更高的細(xì)胞毒性。流式細(xì)胞儀分析MCF-7細(xì)胞周期結(jié)果表明，thiocoraline可將MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在S期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Hoecst33342染

6、色和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，thiocoraline可通過激活Caspase通路而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。在前期系列天然產(chǎn)物抗腫瘤活性研究基礎(chǔ)上，針對(duì)乳腺癌細(xì)胞耐藥性這個(gè)突出問題，以乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/T為研究模型，篩選與thiocoraline耐藥相關(guān)的蛋白，深入探究影響腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物敏感性的因素。通過細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞在體外的增殖速率高于MCF-7/T細(xì)胞。qPCR和Western Blot實(shí)

7、驗(yàn)顯示，thiocoraline作用MCF-7細(xì)胞后，引起Akt蛋白磷酸化，長(zhǎng)期作用下使下游乳腺癌耐藥蛋白(Breast Cancer Resistant Protein，BCRP)的表達(dá)水平升高，通過PI3K/Akt/BCRP通路誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MCF-7細(xì)胞對(duì)thiocoraline的敏感性，隨著細(xì)胞內(nèi)Akt蛋白磷酸化水平的提高而降低。使用Akt磷酸化抑制劑MK-2206HCl可顯著提高M(jìn)CF-7細(xì)胞對(duì)thi

8、ocoraline的敏感性，并且可部分逆轉(zhuǎn)MCF-7/T耐藥細(xì)胞對(duì)thiocoraline的耐藥。
　　總之，thiocoratine長(zhǎng)期處理可使MCF-7細(xì)胞通過PI3K/Akt/BCRP通路產(chǎn)生耐藥性，而MK-2206HCl通過抑制Akt蛋白磷酸化，顯著提高M(jìn)CF-7細(xì)胞對(duì)thiocoraline的敏感性，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗腫瘤活性化合物thicoraline聯(lián)合Akt磷酸化抑制劑MK-2206HCl，或許可以避免化療藥物耐藥