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文檔簡介
1、靈芝(Ganoderma lucidum(Curtis:Fr.)P.Karst.)在我國已有悠久的應用歷史,可用于多種疾病的治療。靈芝的化學、藥理和臨床等現(xiàn)代研究也證明靈芝具有抑制腫瘤、保肝、調節(jié)血壓、降血糖、抗病毒、延緩衰老、抗炎等多種作用,其中靈芝的抗腫瘤作用更是近年來的熱點。由于靈芝的化學成分十分復雜,難以得到純化合物進行抗腫瘤活性及其作用機制的研究,限制了靈芝產業(yè)的深入發(fā)展。本研究室運用分離純化與體外篩選模型相結合的方法,分別得
2、到提高免疫功能的活性成分GLIS和誘導細胞凋亡的有效部位GLAI,本論文在前人工作的基礎上對它們的作用機制進行探討,為將來的進一步研究和開發(fā)建立了基礎。 1.靈芝多糖GLIS的免疫刺激活性研究 靈芝多糖GLIS是經(jīng)過多步色譜分離純化得到的糖蛋白組分,以前的研究發(fā)現(xiàn)GLIS可以激活淋巴細胞,并能夠特異性地刺激淋巴B細胞增殖,增加NK細胞的活性。本論文在前人工作的基礎上,探討了GLIS對小鼠巨噬細胞株RAW264.7、小鼠骨
3、髓來源巨噬細胞(BMMs)和小鼠淋巴細胞(MSLs)的免疫調節(jié)作用,并對激活巨噬細胞的作用機理進行了研究。 GLIS處理小鼠巨噬細胞株RAW264.7后,發(fā)現(xiàn)其形態(tài)發(fā)生了變化,如體積變大,并且形成偽足;同時發(fā)現(xiàn)GLIS能刺激RAW264.7細胞呼吸爆發(fā),產生大量活性氧,并刺激RAW264.7細胞釋放NO,兩項實驗結果證明GLIS可激活免疫巨噬細胞的氧依賴殺傷機制;GLIS還刺激RAW264.7細胞增加IL-1β、IL-12p35
4、和IL-12p40細胞因子mRNA的表達,而細胞因子TNF-α、IL-6和IL-18 mRNA的表達則基本無變化;另外還發(fā)現(xiàn)其分泌TNF-α、IL-1β和IL-12細胞因子的量明顯增加。 GLIS處理小鼠骨髓來源巨噬細胞(BMMs)后,也發(fā)現(xiàn)其體積變大,并且形成偽足;同時GLIS也能刺激BMMs呼吸爆發(fā),產生大量活性氧;并刺激BMMs釋放NO,結果與RAW264.7細胞株實驗相同;GLIS刺激BMMs后相關細胞因子的表達也增加,
5、在mRNA水平,IL-6、IL-12p35和IL-12p40明顯增加,TNF-α、IL-1β和IL-18也有所增加。在蛋白水平,TNF-α、IL-1β和IL-12三種細胞因子的表達明顯增加。 GLIS還可以可刺激淋巴細胞增殖,并且可刺激其呼吸爆發(fā)。 研究結果顯示GLIS通過激活巨噬細胞氧依賴殺傷系統(tǒng)及刺激其表達細胞因子達到全面激活免疫功能進行抗腫瘤的目的。 2.靈芝三萜GLAI誘導腸癌細胞凋亡作用研究 靈
6、芝三萜GLAI是通過活性跟蹤經(jīng)多步分離純化從靈芝子實體中分離得到的一個有效部位,對GLAI的理化性質研究發(fā)現(xiàn),其三萜含量為62.8%;HPLC檢測發(fā)現(xiàn)GLAI含有8個峰,其中有兩個峰確定為靈芝酮二醇和丹芝醇A。GLAI對多種腫瘤細胞株具有抑制活性,包括小鼠淋巴癌L1210細胞株、人淋巴癌K562細胞株、人腸癌SW620細胞株和人乳腺癌MCF7細胞株。GLAI處理SW620細胞后,其細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的變化,細胞變圓、皺縮,體積變小,并可觀
7、察到凋亡小體的產生;經(jīng)過Hoechst3258熒光染色和annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測,證明SW620細胞發(fā)生了凋亡;研究還發(fā)現(xiàn),GLAI處理SW620細胞后,凋亡關鍵酶Caspase-3的活性明顯增高;同時發(fā)現(xiàn),隨著藥物濃度和作用時間的增加,凋亡抑制基因BCL-2 mRNA的表達,逐漸減少;而凋亡促進基因BAX mRNA的表達隨之增加;另外發(fā)現(xiàn),凋亡重要相關因子P53蛋白的表達隨著藥物濃度的增加而增加,而凋亡抑制
8、蛋白XIAP則隨著濃度的增加而減少。 研究結果顯示GLAI能夠通過激活Caspase-3酶途徑誘導腸癌細胞SW620凋亡,同時通過上調凋亡促進因子的表達,下調凋亡抑制因子的表達達到誘導SW620細胞凋亡的效果。 綜上所述,靈芝的抗腫瘤作用一方面是通過靈芝多糖激活免疫細胞,通過提高免疫系統(tǒng)的能力來達到消除腫瘤的目的;另一方面是通過靈芝三萜誘導腫瘤細胞凋亡,從而達到消除腫瘤的效果。因此靈芝的抗腫瘤作用可能是多途徑共同作用的結
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