4-氯苯甲酰小檗胺在血液腫瘤中的作用及其機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開： 第一部分BBD9抑制骨髓瘤細胞生存并誘導(dǎo)細胞凋亡 目的： 觀察BBD9對多發(fā)性骨髓瘤細胞生存的影響及其機制。 方法： MTT法檢測BBD9對多種骨髓瘤細胞株及原代細胞的生長抑制作用，瑞氏染色觀察細胞形態(tài)學(xué)變化，AV—PI法檢測細胞凋亡，檢測DNAladder，流式細胞術(shù)檢測細胞周期，westernblot法檢測caspase，BCL-2家族蛋白及細胞周期調(diào)控蛋白。

2、 結(jié)論： (1)BBD9能抑制多種骨髓瘤細胞株及原代細胞生長。 (2)BBD9誘導(dǎo)骨髓瘤細胞凋亡。 (3)BBD9上調(diào)促凋亡蛋白Bak、Bax和Bim，下調(diào)抑凋亡蛋白Mcl-1。 (4)BBD9通過下調(diào)cyclinA、cyclinB1使細胞周期阻滯于G2/M期。 第二部分BBD9誘導(dǎo)的凋亡伴隨著FOXO3a/Bim途徑激活 目的： 研究BBD9誘導(dǎo)的Bim蛋白表達上調(diào)的機制。

3、 方法： Real—timePCR檢測BimmRNA及mir-17-5p的表達，westernblot分析細胞核內(nèi)FOXO3a及pFOXO3a表達量，免疫熒光顯微鏡觀察FOXO3在細胞內(nèi)的分布。 結(jié)果： BBD9處理U266細胞8h后，BimmRNA拷貝數(shù)明顯增加。與此同時，對BimmRNA起負調(diào)控作用的成熟體小RNA—mir-17-5p明顯下調(diào)。3μg/mlBBD9處理時，mir-17-5p下降至未處理組

4、的0.35±0.23倍。Westernblot結(jié)果顯示，BBD9處理的U266細胞核內(nèi)Bim基因轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a的表達量較未處理的U266細胞明顯升高。與此相反，核內(nèi)pFOXO3a蛋白量隨著BBD9濃度的增加而減少。免疫熒光顯微鏡下可以看到：在BBD9處理前，U266細胞胞核內(nèi)FOXO3a表達較低，胞漿內(nèi)FOXO3a表達相對較高；而在2μg/mlBBD9處理24h后，U266細胞胞核內(nèi)FOXO3a的熒光較強，而胞漿中FOXO3a則較

5、弱。同樣地，在BBD9處理前，RPMI8226細胞胞核內(nèi)FOXO3a熒光較弱，胞漿內(nèi)FOXO3a熒光則相對更強；而在2μg/mlBBD9處理24h后，RPMI8226細胞胞核內(nèi)FOXO3a的熒光較強，而胞漿中FOXO3a則較弱。 結(jié)論： (1)BBD9通過提高胞核內(nèi)FOXO3a的表達量，促進Bim基因轉(zhuǎn)錄，增加BimmRNA拷貝數(shù)，從而導(dǎo)致Bim蛋白表達上調(diào)。 (2)BBD9還通過下調(diào)mir-17-5p，減少Bi

6、mmRNA降解或?qū)immRNA翻譯的抑制，從而使Bim蛋白表達上調(diào)。 第三部分BBD9抑制IL-6信號傳導(dǎo)途徑的激活 目的： 通過觀察IL-6信號傳導(dǎo)途徑中參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的各種分子的改變，進一步闡明BBD9誘導(dǎo)的骨髓瘤細胞凋亡的分子機制。 方法： MTT檢測外源性IL-6對BBD9誘導(dǎo)的U266細胞生長抑制的影響，ELISA檢測U266細胞培養(yǎng)上清IL-6水平，流式細胞術(shù)檢測細胞膜上IL-6R的表

7、達量，Real—timePCR檢測細胞IL-6mRNA及IL-6RmRNA表達量，westernblot檢測細胞內(nèi)各種激酶的磷酸化水平。 結(jié)果： 外源性IL-6減弱BBD9誘導(dǎo)的生長抑制。U266細胞在1μg/mlBBD9作用24h后，其生存率為88.83％，加用150ng/mlIL-6后，其生存率顯著升高至104.83％；2gg/mlBBD9作用24h后，U266細胞的生存率僅有43.03％，而加用IL-6后，其生存率

8、顯著升高至55.93％。ELISA法檢測U266細胞培養(yǎng)上清IL-6水平，發(fā)現(xiàn)BBD9能減少自分泌的IL-6。0、1、2、3μg/mlBBD9處理24h后，U266細胞培養(yǎng)上清中IL-6水平分別為33.49±7.92pg/ml、10.34±5.83pg/ml、13.59±7.22pg/ml、10.78±6.67pg/ml。此外，細胞膜上IL-6R的表達量也略有下降。1、2、3μg/mlBBD9處理8h，IL-6mRNA表達量分別是未處理

9、組的0.9、3、2.7倍，而IL-6RmRNA無明顯變化。BBD9處理后，U266細胞內(nèi)IL-6信號傳導(dǎo)途徑中兩個重要的激酶STAT3及AKT磷酸化水平均明顯下調(diào)，而其總STAT3及總AKT均無改變。 結(jié)論： (1)BBD9抑制骨髓瘤細胞自分泌IL-6及細胞膜IL-6R的合成，但并不在mRNA水平抑制二者的表達。 (2)BBD9使骨髓瘤IL-6信號傳導(dǎo)途徑的STAT3和P13K/AKT途徑受抑。 (3)I

10、L-6信號傳導(dǎo)途徑受阻是BBD9誘導(dǎo)骨髓瘤細胞凋亡的一個重要機制。 第四部分BBD9增加多藥耐藥K562/A02細胞對阿霉素的敏感性及其機制 目的： 研究BBD9能否逆轉(zhuǎn)p-gp介導(dǎo)的急性白血病多藥耐藥及其機制。 方法： MTT檢測細胞對阿霉素的耐藥性，流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡率、測定細胞內(nèi)阿霉素濃度及檢測細胞膜表面p—gp表達量的變化，Real—timePCR檢測細胞內(nèi)mdr-1mRNA表達。

11、 結(jié)果： 阿霉素作用于K562/A02細胞24h的IC50為7.57/μg/ml，作用于K562細胞24h的IC50為0.651μg/ml，K562/A02細胞耐藥指數(shù)為11.65。2μg/ml阿霉素與1μg/mlBBD9單獨或聯(lián)合處理K562/A02細胞24h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：2μg/ml阿霉素處理組細胞凋亡率為6.04±2.28％，1μg/mlBBD9處理組細胞凋亡率為8.21±5.74％，對照組細胞凋亡率為6.59±3：2

12、.56％。然而，2μg/ml阿霉素與1μg/mlBBD9聯(lián)合處理組，細胞凋亡率明顯升高至35.93±1.87％，與對照組相比差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。但是，0.4μg/ml阿霉素與1μg/mlBBD9單獨或聯(lián)合處理K562細胞24h，結(jié)果顯示：對照組凋亡率為1.77±0.58％，單用BBD9組凋亡率為3.52±2.0％，單用阿霉素組為11.77±8.44％，而BBD9聯(lián)合阿霉素組的凋亡率為2.93±0.48％，各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。檢

13、測細胞內(nèi)阿霉素濃度顯示，BBD9處理1h，能使阿霉素陽性K562/A02細胞由單用阿霉素時的8.88±12.98％升高至87.82±12.03％；BBD9處理24h，能使K562/A02細胞阿霉素的平均熒光強度由單用阿霉素時的39.78±3.64％升高至54.4±5.63％。進一步的結(jié)果顯示，BBD9并不能減少mdr-1mRNA的表達，也不能影響細胞膜上p—gp蛋白的表達。 結(jié)論： (1)BBD9能增加K562/A02細

14、胞對阿霉素的敏感性，而不能增加K562細胞對阿霉素的敏感性。 (2)BBD9通過提高p—gp高表達的K562/A02細胞內(nèi)阿霉素濃度使得細胞對阿霉素的敏感性增加。 (3)BBD9對化療藥物的增敏作用并不涉及p—gp蛋白數(shù)量的改變，可能是通過抑制p—gp的泵功能達到增敏作用的。 總結(jié)： BBD9具有抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞株及原代細胞生長的作用。這種生長抑制作用是與細胞凋亡有關(guān)的。在BBD9誘導(dǎo)的骨髓瘤細胞凋亡

15、過程中，促凋亡蛋白Bim、Bax及Bak上調(diào)，而抑凋亡蛋白Mcl-1則下調(diào)。BBD9能通過下調(diào)cyclinA、cyclinB1使細胞周期阻滯于G2/M期。此外，BBD9還能增加骨髓瘤細胞核內(nèi)FOXO3的表達量，抑制mir-17-5p，最終導(dǎo)致Bim蛋白表達增加。BBD9能抑制U266細胞IL-6和IL-6R合成，并抑制IL-6信號傳導(dǎo)途徑的兩個重要途徑：STAT3和PI3K/AKT途徑。說明IL-6信號傳導(dǎo)途徑受阻是BBD9誘導(dǎo)的骨髓瘤