一株高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺綠針假單胞菌工程菌株P(guān)3Δlon的構(gòu)建及其發(fā)酵條件優(yōu)化的研究.pdf

1、綠針假單胞菌HT66（Pseudomonas chlororaphis HT66）是本實(shí)驗(yàn)室從水稻根際分離得到的一株可合成吩嗪類抗生素的假單胞菌，其吩嗪-1-甲酰胺（Phenazine-1-carboxamide，PCN）產(chǎn)量為425 mg/L。前期張平原同學(xué)通過多輪物理和化學(xué)誘變篩選得到一株高產(chǎn)誘變株P(guān)3，PCN產(chǎn)量可達(dá)1697 mg/L，已完成全基因組測序及蛋白質(zhì)組比對分析。本研究結(jié)合誘變育種和基因工程定向改造技術(shù)構(gòu)建了一株高產(chǎn) P

2、CN工程菌株，并通過響應(yīng)面法對其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，大大提高了PCN產(chǎn)量。
　　首先，本研究以P3株為出發(fā)菌株，除了原有的紫外線誘變和亞硝基胍誘變方法，又采用了硫酸二乙酯誘變法，經(jīng)過5輪交替誘變篩選得到一株高產(chǎn)PCN誘變株T9，其PCN產(chǎn)量達(dá)到2095 mg/L，比P3株提高了398 mg/L，為野生株的4.93倍。與野生株相比，誘變株T9的形態(tài)也發(fā)生了一定變化，表現(xiàn)為：菌落變大，邊緣變得模糊且不規(guī)則，PCN綠色晶體由菌落中央向四

3、周呈放射狀發(fā)散。由于遺傳背景和表型發(fā)生較大變化，在T9株上進(jìn)行基因操作較為困難。
　　此外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道lon和parS基因負(fù)調(diào)控假單胞菌中吩嗪合成的機(jī)制，本研究利用無痕敲除技術(shù)在野生株HT66上構(gòu)建了lon/parS基因的單突變株HT66Δlon、HT66ΔparS和雙突變株HT66ΔlonΔparS，PCN產(chǎn)量分別為1102 mg/L、2053 mg/L和2425 mg/L，分別為野生型的2.59倍、4.83倍和5.71倍，證明

4、lon和parS對于PCN合成有明顯的抑制作用。但是，在P3株上構(gòu)建lon/parS基因的雙敲除株并沒有得到PCN產(chǎn)量疊加的效果，雙突變株P(guān)3ΔlonΔparS中PCN產(chǎn)量為2849 mg/L，而單獨(dú)敲除lon得到的突變株P(guān)3Δlon中PCN產(chǎn)量最高，達(dá)到3617 mg/L，為P3株的2.13倍，野生株的8.51倍?？梢?，多輪誘變已導(dǎo)致P3株的遺傳背景發(fā)生較大改變。另外，通過在P3株上敲除phzH基因，初步驗(yàn)證了其對吩嗪合成的修飾功能；

5、敲除phzH基因后，突變株P(guān)3ΔphzH次級代謝產(chǎn)物由PCN變?yōu)榉脏?1-羧酸（簡稱PCA），產(chǎn)量達(dá)1704 mg/L。
　　最后，以PCN高產(chǎn)突變株P(guān)3Δlon為研究對象，對其發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行了優(yōu)化。通過單因素實(shí)驗(yàn)對其發(fā)酵培養(yǎng)基組分包括碳源、氮源和無機(jī)鹽進(jìn)行了初步研究，并選擇6個(gè)營養(yǎng)因子：甘油、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、KNO3、FeCl3和K2HPO4作為PB設(shè)計(jì)試驗(yàn)的篩選對象；通過試驗(yàn)篩選得到3個(gè)對PCN產(chǎn)量影響最為顯著的因子

6、：甘油、胰蛋白胨和大豆蛋白胨；進(jìn)一步通過響應(yīng)面法研究了三個(gè)因子間的相互影響，優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為：甘油37.08 mL/L，胰蛋白胨20.00 g/L，大豆蛋白胨25.03 g/L；最后通過搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對響應(yīng)面模型的預(yù)測做了驗(yàn)證，優(yōu)化的培養(yǎng)基中PCN產(chǎn)量達(dá)到9415 mg/L，為優(yōu)化前的2.60倍，為野生株HT66的22.15倍。該產(chǎn)量為目前國際上報(bào)道的生物合成吩嗪化合物最高產(chǎn)量的1.5倍左右。
　　本論文的研究不僅為研究綠針假單