高產(chǎn)乳鏈菌肽基因工程菌株的構(gòu)建及其發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、乳鏈菌肽(Nisin)，是由某些乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L.lactis）在其生長代謝過程中分泌的一種生物多肽類細(xì)菌素，具有良好的抑菌效應(yīng)，對一些食源性腐敗菌或有害菌具有強(qiáng)烈的抑制或殺滅作用。長期以來，該抗菌肽主要作為一種安全高效的天然綠色生物防腐劑普遍用于食品加工企業(yè)。此外，在醫(yī)藥研究（抗生素替代品、生殖避孕、醫(yī)學(xué)移植、腫瘤研究）及農(nóng)業(yè)飼料等領(lǐng)域也極具廣闊的應(yīng)用前景。
　　而在當(dāng)前經(jīng)濟(jì)與技術(shù)條件下，商品

2、化Nisin的生產(chǎn)主要通過微生物發(fā)酵方法進(jìn)行，尚存在工業(yè)化產(chǎn)率低，生產(chǎn)成本較高等共性問題。隨著生物防腐劑市場需求的日益增大，合理選育Nisin高產(chǎn)菌株，優(yōu)化其生產(chǎn)菌發(fā)酵性能，提高Nisin工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵水平，降低發(fā)酵生產(chǎn)成本，已然成為亟需解決的問題。盡管采用傳統(tǒng)誘變、基因組雜交等微生物篩選技術(shù)選育Nisin高產(chǎn)菌株已取得一定效果，但這些方法篩選過程復(fù)雜繁瑣，工作量較大，獲得高產(chǎn)菌株的效率低，而且所獲得高產(chǎn)菌株往往容易退化，不足以支持長期

3、穩(wěn)定的發(fā)酵應(yīng)用。近些年來，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展與應(yīng)用，Nisin的生物合成基因簇及其代謝調(diào)控途徑已逐漸得以清晰闡明，越來越多的研究人員嘗試基于代謝途徑工程技術(shù)來構(gòu)建高效表達(dá)Nisin的基因工程菌株，以期望進(jìn)一步提高Nisin的工業(yè)化水平。
　　目前Nisin產(chǎn)生菌的代謝工程改造主要通過對影響Nisin生物合成的相關(guān)負(fù)調(diào)控基因進(jìn)行敲除或改變其合成途徑中特定元件表達(dá)水平，或?qū)isin的生物合成途徑進(jìn)行異源表達(dá)來提高其發(fā)酵性能。本論

4、文基于對Nisin生物合成途徑中關(guān)鍵基因的功能表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識，以乳酸乳球菌ATCC11454基因組DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增獲得Nisin生物合成途徑中的關(guān)鍵基因nisA（前體基因）ORF和nisRK（調(diào)控基因）片段，并通過同源重組技術(shù)將nisA ORF和nisRK基因克隆至高拷貝的表達(dá)質(zhì)粒pMG36e中，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體pMG36e-nisA和pMG36e-nisA-nisRK。以Nisin產(chǎn)生菌乳酸乳球菌LS01為受體

5、菌，通過電轉(zhuǎn)化和抗性篩選，獲得過表達(dá)nisA的工程菌株LS01/pMG36e-nisA及聯(lián)合過表達(dá)nisA和nisRK的工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，工程菌株LS01/pMG36e-nisA的Nisin效價(jià)可達(dá)1955 IU/mL，比原始菌株(1472 IU/mL)提高了32.8％;工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK的Nisin效價(jià)峰值達(dá)到2470IU/mL，比原始菌株提升了6

6、7.8％。生物量測定分析表明，工程菌LS01/pMG36e-nisA和LS01/pMG36e-nisA-nisRK的生長狀況相對于原始菌株也發(fā)生了較明顯的變化，其最大生物量相對于原始菌株均略有降低，且后者下降更明顯。半定量RT-PCR檢測結(jié)果表明，目的基因nisA、nisR和nisK在工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK中的轉(zhuǎn)錄水平均得到了上調(diào)，證實(shí)了基因nisA、nisR和nisK的過表達(dá)對Nisin的生物合成具有顯著

7、促進(jìn)作用。
　　利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選與優(yōu)化，以進(jìn)一步提升工程菌株的發(fā)酵性能。結(jié)果獲得優(yōu)化后培養(yǎng)基組成為:蔗糖25.06 g/L，玉米漿粉末8.8 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO45 g/L，NaCl2 g/L，MgSO4·7H2O0.3 g/L，CaCO33.5 g/L，Tween-802.7 g/L。搖瓶驗(yàn)證結(jié)果表明，優(yōu)化后工程菌株LS01/pM

8、G36e-nisA-nisRK的Nisin發(fā)酵水平可達(dá)到3037IU/mL，比優(yōu)化處理前提升了23％，比原始菌株產(chǎn)量更是提高了106％。利用所得的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基與工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK在10L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵研究，結(jié)果表明優(yōu)產(chǎn)工程菌株在該發(fā)酵體系中Nisin發(fā)酵效價(jià)可達(dá)6380IU/mL，比原始生產(chǎn)菌在初始發(fā)酵培養(yǎng)基條件中產(chǎn)量提高了46.2％，較大地發(fā)揮了工程菌株的發(fā)酵潛力。
　　綜上所述，利