根際促生假單胞菌的比較基因組學(xué)研究與綠針假單胞菌優(yōu)勢(shì)小基因組菌株的構(gòu)建.pdf

1、隨著合成生物學(xué)的迅猛發(fā)展，底盤細(xì)胞的構(gòu)建在生物技術(shù)領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用前景。而微生物基因組的精簡(jiǎn)優(yōu)化逐漸成為構(gòu)建底盤細(xì)胞的重要策略。假單胞菌（Pseudomonas）具有明顯的代謝和生理多樣性，因此能夠抵抗各種內(nèi)源和外源壓力，合成多種生物活性物質(zhì)，適應(yīng)不同的物理化學(xué)和營(yíng)養(yǎng)生境。同時(shí)，隨著假單胞菌基因組數(shù)據(jù)的大量公布，促使其遺傳背景逐漸清晰。因此，環(huán)境來源的假單胞菌屬工業(yè)生產(chǎn)菌株能夠作為模式菌株，進(jìn)行基因組的刪減和遺傳改造，從而構(gòu)建優(yōu)勢(shì)小

2、基因組菌株生產(chǎn)工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域的重要化學(xué)品和藥品，滿足當(dāng)前和未來合成生物學(xué)和生物技術(shù)的需求。綠針假單胞菌GP72（P. chlororaphis GP72）是本實(shí)驗(yàn)室從甜椒根際分離得到的生防菌株，能夠分泌吩嗪（phenazine）類抗生素和其他生防活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。本研究以綠針假單胞菌為主要研究對(duì)象，開展假單胞菌屬根際促生菌的比較基因組學(xué)研究，得到的研究結(jié)果一方面用于指導(dǎo)提高菌株生防特性的研究，另一方面指導(dǎo)菌株基因組刪減工作，從而

3、構(gòu)建高產(chǎn)吩嗪類化合物的小基因組菌株。
　　我們根據(jù)底盤細(xì)胞的構(gòu)建需求，首先利用比較基因組學(xué)的方法掌握綠針假單胞菌根際促生特性的基因、必需基因以及重要功能基因和調(diào)控基因；然后采用無痕敲除方法進(jìn)行大片段的基因組連續(xù)刪減，從而構(gòu)建系列小基因組菌株；最后對(duì)菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行表征，為后續(xù)合成生物學(xué)的研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供詳細(xì)的理論依據(jù)和優(yōu)化的技術(shù)支持。本課題的主要研究?jī)?nèi)容和發(fā)現(xiàn)包含以下四個(gè)方面：
　　第一、利用高通量測(cè)序技術(shù)完成了對(duì)綠

4、針假單胞菌GP72的全基因組測(cè)序。菌株GP72的基因組是該種公布的第一個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù)，為6,663,241 bp長(zhǎng)度的環(huán)狀染色體，其G+C含量為63.1%?；蚪M注釋揭示了菌株生防作用的遺傳基礎(chǔ)。
　　第二、開展四株代表性假單胞菌屬根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）的比較基因組學(xué)研究。通過比較非致病性的生防菌株熒光假單胞菌Pf-5（P. fluorescens Pf-5）和

5、綠針假單胞菌GP72，甜瓜根際分離的生防菌株銅綠假單胞菌 M18（P. aeruginosa M18）以及根際固氮細(xì)菌斯氏假單胞菌 A1501（P. stutzeri A1501）的基因組系統(tǒng)性揭示根際促生特性的相關(guān)基因。菌株GP72的編碼基因與其他三株細(xì)菌的基因組同時(shí)比較，得到603個(gè)保守性基因，揭示了假單胞菌屬PGPR的根際促生共性。而在菌株GP72中存在的特異性促生基因包括：合成不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物、差異的重金屬抗性機(jī)制（cus操縱

6、子）以及額外的菌毛合成系統(tǒng)（tad操縱子），揭示了綠針假單胞菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和特異的生物學(xué)功能。
　　第三、初步掌握綠針假單胞菌的必需基因信息。與不同革蘭氏陰性菌的必需基因進(jìn)行序列比對(duì)，推測(cè)綠針假單胞菌GP72中的必需基因至少為215個(gè)，為后續(xù)基因組精簡(jiǎn)與優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。
　　第四、利用比較基因組學(xué)的方法結(jié)合“自上而下”基因組刪減策略，從而構(gòu)建假單胞菌屬的優(yōu)勢(shì)小基因組菌株。本文采用自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法連續(xù)敲除22個(gè)染

7、色體片段，占基因組的10%。在22個(gè)突變株中，最小基因組菌株MDS22的2-羥基吩嗪產(chǎn)量是原始菌株的4.4倍，為99.1 mg/L，但該菌株的生長(zhǎng)緩慢；而在菌株MDS10中，吩嗪總產(chǎn)量最高，為852.0 mg/L，且表現(xiàn)良好的生長(zhǎng)趨勢(shì)。高產(chǎn)吩嗪菌株MDS10的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示其高產(chǎn)特性可能與吩嗪的分泌有關(guān)，且菌株的生長(zhǎng)和吩嗪的合成與鐵離子代謝密切相關(guān)。
　　綜上，本文以綠針假單胞菌GP72為主要研究對(duì)象，從合成生物學(xué)的角度，利用比較