嗜水氣單胞菌流行株基因組特征及毒力相關(guān)基因研究.pdf

1、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila），是引起淡水魚敗血癥的主要病原，也可引起人類感染發(fā)病，是一種人-畜-魚共患的致病微生物。該菌致病機(jī)制復(fù)雜，迄今為止還有許多未知毒力因子尚未發(fā)現(xiàn)。全面鑒定嗜水氣單胞菌毒力基因?qū)⒂兄谌藗儗υ摬≡姆肿又虏C(jī)制有更加深入的認(rèn)識(shí)，為控制和預(yù)防該菌引發(fā)的傳染病的發(fā)生提供更多手段和途徑。然而，目前嗜水氣單胞菌中國分離株尚未進(jìn)行全基因組測序，無法全面破譯其遺傳信息，并且缺乏合適的毒力評(píng)估模型

2、，這些都限制了該菌致病機(jī)制的研究。本研究對嗜水氣單胞菌中國流行株進(jìn)行了全基因組測序分析，鑒定出流行株所特有的3條代謝途徑，確定了ST251型菌株為中國和美國地區(qū)的主要流行株，并建立了以四膜蟲為模型評(píng)估氣單胞菌毒力的方法，利用轉(zhuǎn)座子插入突變技術(shù)結(jié)合四膜蟲模型，篩選出新的毒力相關(guān)基因。研究結(jié)果不僅豐富了對嗜水氣單胞菌致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也為毒力菌株的高通量篩選探索了一條新途徑。
　　1.嗜水氣單胞菌全基因組測序及比較基因組學(xué)研究

3、>　　首次對分離自不同年代的嗜水氣單胞菌中國流行株NJ-35和J-1進(jìn)行了全基因組測序，并與已公布的嗜水氣單胞菌的基因組進(jìn)行了比較基因組學(xué)研究。研究結(jié)果表明，中國流行株和美國流行株的親緣關(guān)系很近，其基因組具有高度的相似性，均屬于ST251型菌株。對流行株和環(huán)境分離株毒力因子的分析結(jié)果表明，已知的毒力因子如Ⅲ型分泌系統(tǒng)、Ⅵ型分泌系統(tǒng)以及側(cè)生鞭毛系統(tǒng)等并不是ST251型流行株所必需的毒力因子。另外，本研究鑒定出了包括前噬菌體、O抗原等27個(gè)

4、基因組適應(yīng)性區(qū)域，其中編碼肌醇、唾液酸以及L-巖藻糖等3條代謝途徑的基因區(qū)域只存在于ST251型流行株中，表明這三條代謝途徑有可能是流行株與環(huán)境分離株之間的毒力差異之所在。該研究對嗜水氣單胞菌的遺傳信息進(jìn)行了全面的破譯，為其致病機(jī)制的研究提供了豐富的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)及新的見解。
　　2.ST251型菌株的地理分布及致病生物學(xué)特性分析
　　對ST251型菌株的分離地點(diǎn)和來源進(jìn)行了溯源，確定了ST251型菌株即為中國和美國地區(qū)的主要流行

5、株。對30株嗜水氣單胞菌毒力的分析結(jié)果表明，ST251型菌株均為有毒株。毒力因子的分析結(jié)果表明，所有菌株包括ST251型等有毒株均不含有Ⅲ型分泌系統(tǒng)及側(cè)生鞭毛系統(tǒng)，說明這兩種毒力因子并不是ST251型等強(qiáng)毒株發(fā)揮致病性所必需的毒力因子，而Ⅱ性分泌系統(tǒng)在所有菌株中均保守存在，說明該分泌系統(tǒng)對于細(xì)菌胞外產(chǎn)物的分泌是足夠且必需的，但其不能作為細(xì)菌毒力的判定標(biāo)識(shí)。對ST251型菌株的致病特性分析表明，ST251型菌株與其他ST型菌株在生物被膜形

6、成能力、運(yùn)動(dòng)能力、胞外產(chǎn)物的溶血活性及蛋白酶活性等方面并不存在規(guī)律性差異，但是它們可以利用肌醇、唾液酸和L-巖藻糖來進(jìn)行生長，并且在小鼠體內(nèi)的存活能力更強(qiáng)，表明其所含有的肌醇、唾液酸和L-巖藻糖等代謝途徑可能會(huì)有助于細(xì)菌在宿主體內(nèi)獲得營養(yǎng)物質(zhì)，增強(qiáng)細(xì)菌在宿主體內(nèi)的生存和增殖能力，從而使得該序列型菌株能夠成為強(qiáng)毒力菌株，并廣泛流行。
　　3.氣單胞菌毒力評(píng)估模型的建立
　　對以四膜蟲作為模型宿主評(píng)估氣單胞菌毒力的可行性進(jìn)行分析

7、，分析結(jié)果表明:四膜蟲與氣單胞菌共培養(yǎng)后，菌株的相對存活率與該菌株對斑馬魚的半數(shù)致死量(LD50)呈負(fù)相關(guān)，皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.683(P＜0.01);而四膜蟲的相對存活率與該菌株對斑馬魚的LD50呈正相關(guān)，皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.743(P＜0.01)。經(jīng)分析確定:如以細(xì)菌的相對存活率為判定依據(jù)，則相對存活率高于60％時(shí)，可判定該菌株為有毒株;低于40％時(shí)，判定為無毒株;如以四膜蟲的相對存活率為判定依據(jù)，當(dāng)四膜蟲相對存活率低于40％時(shí)，

8、判定該菌株為有毒株，而高于50％時(shí)，判定為無毒株?？傮w而言，我們成功建立了以四膜蟲為模型宿主評(píng)估氣單胞菌毒力的方法，為評(píng)估氣單胞菌毒力提供了一條可靠、簡單的途徑
　　4.嗜水氣單胞菌突變體庫的建立及毒力相關(guān)基因的篩選
　　以ST251型嗜水氣單胞菌流行株NJ-35為親本株，利用轉(zhuǎn)座子插入突變技術(shù)建立了含有1030株插入突變株的突變體庫，并以四膜蟲為模型篩選到了94株毒力顯著減弱的突變株，然后以斑馬魚為模型對其中毒力降低最明顯

9、的36株突變株的毒力再次進(jìn)行評(píng)估，鑒定出了33株半數(shù)致死量上升1個(gè)數(shù)量級(jí)以上的突變株，最終鑒定出了19個(gè)轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)，其中7個(gè)插入位點(diǎn)位于非編碼區(qū)域，12個(gè)插入位點(diǎn)位于編碼區(qū)域，這些被插入失活的基因主要編碼菌毛基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子(transcriptionalregulator)、位于O抗原基因簇的葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶（glucose-1-phosphatethymidylyltrans ferase，RmlA）、幾丁質(zhì)酶(ch

10、itinase A，ChiA)、機(jī)械敏感性離子通道蛋白(mechanosensitive ion channel protein)以及鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)子(potassium transporter,TrkH)等。對插入突變株的致病生物學(xué)特性分析表明，不同突變株對四膜蟲、斑馬魚以及HEp-2細(xì)胞的毒力都有所降低，但各突變株在生長能力、運(yùn)動(dòng)能力等其他生物學(xué)特性上的表型并不一致。該研究鑒定出了12個(gè)嗜水氣單胞菌的毒力相關(guān)基因，加深了對該病原菌致病機(jī)

11、制的了解，為該菌致病機(jī)制的研究提供了科學(xué)依據(jù)。
　　5.嗜水氣單胞菌chiA和trkH基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性分析
　　針對插入突變技術(shù)篩選到的基因chiA和trkH，為了探討其功能，采用同源重組技術(shù)，以ST251型嗜水氣單胞菌NJ-35為親本株，以pYAK1為自殺性質(zhì)粒構(gòu)建了chiA和trkH的基因缺失株，并以穿梭質(zhì)粒pMMB207構(gòu)建了相應(yīng)的互補(bǔ)株。對缺失株、互補(bǔ)株和野生株的生物學(xué)特性研究表明，chiA基因缺失后，其

12、生長能力、運(yùn)動(dòng)能力沒有改變，但是其對四膜蟲、斑馬魚以及HEp2細(xì)胞的毒力顯著降低，其胞外產(chǎn)物的溶血活性和蛋白酶活性稍有降低，另外其在小鼠體內(nèi)的存活能力也顯著下降;trkH基因缺失后，其生長能力、運(yùn)動(dòng)能力沒有改變，但是其對四膜蟲、斑馬魚以及HEp-2細(xì)胞的毒力顯著降低，并且其降低程度要大于chiA基因的缺失株，其胞外產(chǎn)物的溶血活性和蛋白酶活性也稍有降低，另外其在小鼠體內(nèi)的存活能力也顯著下降。本研究說明chiA和trkH兩個(gè)基因在嗜水氣單胞