利用微陣列比較基因組雜交技術分析牙齦卟啉單胞菌臨床株與低毒力標準株ATCC33277基因組差異.pdf

1、目的：
　　本研究利用慢性牙周炎患者口腔中采集的齦下菌斑，在實驗室環(huán)境下分離培養(yǎng)牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)臨床株，并使用微陣列比較基因組雜交（array-based Comparative Genomic Hybridization,array-CGH)技術分析P.gingivalis臨床株與低毒力標準株ATCC33277在全基因組水平上的遺傳學差異，分析差異基因與

2、細菌致病能力之間關系，定位高度可疑毒力基因。為今后使用基因芯片技術尋找P.gingivalis致病基因，臨床大范圍篩查感染高毒力克隆株的高危人群，以及牙周炎基因疫苗靶位點選擇提供幫助，最終為疾病的預防和診治提供指導。
　　方法：
　　1.研究對象選擇：選擇慢性牙周炎患者45例，排除其他全身系統(tǒng)性疾病，過去六個月內未曾服用抗生素或接受牙周系統(tǒng)性治療者，無吸煙史，排除妊娠期及哺乳期婦女，知情同意。每位志愿者選擇病變最嚴重部位以及

3、健康或存在輕度齦炎部位納入研究，記錄采樣部位各項牙周指標，所有檢查及指標觀察均由同一檢查者完成。
　　2.標本采集與細菌培養(yǎng)鑒定：收集采樣位點齦下菌斑置于轉送液中，稀釋后接種于牛腦心浸出液(BrainHeart Infusion,BHI)培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)，經分離、次代純化培養(yǎng)、固體增菌后收集菌體待用。使用試劑盒提取DNA，采用P.gingivalis特異性引物進行聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，

4、PCR)，記錄出現(xiàn)陽性條帶樣本，經測序比對進一步確認。
　　3.微陣列基因芯片：使用前期實驗中自主設計構建的全基因組規(guī)模的array-CGH芯片平臺，覆蓋美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI)上公布的12株P.gingivalis菌的基因組序列信息。
　　4.芯片雜交：利用array-CGH技術對P.gingivalis臨床分離株與低毒

5、力標準株P.gingivalis ATCC33277基因組進行比較雜交。以ATCC33277自身雜交為陰性對照，以高毒力株P.gingivalis W83與ATCC33277雜交為陽性對照?；蚪MDNA經酶切，熒光標記及純化后，1:1混合與芯片上探針競爭雜交。
　　5.結果分析及PCR驗證：掃描芯片獲得探針信號，所得差異基因利用基本局部比對搜索工具（Basic Local Aligment Search Tool，BLAST)進行

6、同源比對，利用PCR反應對芯片結果進一步驗證。
　　6.差異基因分析：P.gingivalis菌株間進行同源性分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖，進一步分析所得差異基因的功能以及與細菌毒力強弱之間關系。
　　結果：
　　1.本研究從45名慢性牙周炎患者的90個齦下菌斑樣品中成功分離出142個特征性黑色菌落。
　　2.經PCR特異性擴增及測序比對確認，共成功分離出10株P.gingivalis單克隆株，其中9株培養(yǎng)成功。健康

7、及輕度牙齦炎位點僅分離出1株臨床株，其余8株采樣位點均為牙周炎嚴重病變位點。為豐富基因多樣性，從同一采樣位點分離的臨床株僅挑取一株進行后續(xù)實驗，因此選取6株P.gingivalis臨床株進行后續(xù)實驗。
　　3.基因組DNA與基因芯片上探針競爭結合，掃描后獲得熒光信號，與自身雜交的標準株ATCC33277為均一的黃色信號，而6株臨床株與ATCC33277雜交呈現(xiàn)強弱不等的紅綠混雜信號，不同菌株雜交結果不一，提示P.gingivali

8、s不同菌株基因組DNA存在基因多樣性和異質性。
　　4.臨床株與高毒力株同源性較高，輕度齦炎位點與牙周炎重度病變位點分離的P. gingivalis菌株無顯著基因差異。
　　5.利用array-CGH技術比較臨床株與低毒力株ATCC33277全基因組DNA，發(fā)現(xiàn)多處基因拷貝數(shù)差異，其中包括一段長度約34.5kb的連續(xù)差異片段PGN—0060到PGN—0095，為ATCC33277特有的轉座接合子CTnPg1-a中的一部分，與

9、細菌基因水平轉移功能密切相關。另外，4株以上臨床株拷貝數(shù)增加的102個基因均為高毒力株W83與TDC60基因組特有，其中包括兩個連續(xù)基因片段PG1473到PG1490和PGTDC60—RS04345到PGTDC60—RS04405，長度分別是15.7kb和17.4kb，所包含的基因大部分與細菌轉座結合功能相關。兩個片段的結構及組成與致病島（Pathogenicity Islands，PAIs)特征吻合，可能為P. gingivalis毒