根際來(lái)源銅綠假單胞菌生防株M18全基因組與溫度依賴轉(zhuǎn)錄組的比較分析研究.pdf

1、假單胞菌M18是本實(shí)驗(yàn)室1996年在上海郊區(qū)甜瓜根際分離的高產(chǎn)兩種抗生素吩嗪-1-羧酸和藤黃綠菌素的植物生防菌，其產(chǎn)品申嗪霉素已廣泛應(yīng)用于我國(guó)的植物保護(hù)工作中，對(duì)于我國(guó)糧食生產(chǎn)安全具有重要的保障作用。而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)M18菌株與條件性致病菌銅綠假單胞菌遺傳背景最為接近，但該菌株又與銅綠假單胞菌在表型和基因調(diào)控方式上存在巨大差異，因此闡明假單胞菌M18的遺傳組成，對(duì)研究其生防機(jī)理具有重要意義。
　　 本論文從基因組、表型、轉(zhuǎn)

2、錄組和基因組島功能等角度，分析了M18菌株特殊基因組的特點(diǎn)，對(duì)于環(huán)境響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組變化和特定基因組島的功能，以期發(fā)掘該菌株的優(yōu)良生防功能和獨(dú)特基因組結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的原因，主要結(jié)果如下:
　　 第一、利用下一代高通量測(cè)序技術(shù)，本文全基因組測(cè)序M18菌株基因組，發(fā)現(xiàn)M18基因組由一條長(zhǎng)6327754bp的環(huán)狀染色體構(gòu)成，含有5684個(gè)編碼基因和80個(gè)RNA基因。序列分析顯示M18菌株基因組序列與已測(cè)序銅綠假單胞菌基因組同源性最高，達(dá)到90％

3、以上，并且全基因組比對(duì)、進(jìn)化樹分析和COG基因分類比較均顯示相同現(xiàn)象，因此將該生防菌株定名為Pseudomonas aeruginosaM18?；蚪M水平分析發(fā)現(xiàn)，相比其它人體分離的銅綠假單胞菌基因組，根際分離的M18菌株基因組具有多個(gè)特點(diǎn)，包括含有最多數(shù)量的CRISPR和最少的IS遺傳元件，有助于維持其基因組穩(wěn)定。此外，M18菌株附加基因組不含任何臨床分離株的致病性基因組島，由5個(gè)基因組島和2個(gè)原噬菌體島組成，其中含有限制性修飾系統(tǒng)、

4、抗生素合成、糖基化修飾、營(yíng)養(yǎng)物分解等功能基因，有助于M18菌株的根際環(huán)境適應(yīng)。同時(shí)，M18菌株基因組攜帶5類次生生防相關(guān)代謝產(chǎn)物的合成基因簇，也對(duì)菌株的生防作用起到重要作用。
　　 第二、本文通過(guò)研究銅綠假單胞菌M18和近源高致病性菌株的致病性基因和耐藥性基因，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)菌株存在致病基因上存在多處基因差異，在核心基因組中的耐藥性基因上差異較小。之后，開展小鼠肺部急性感染競(jìng)爭(zhēng)和抗菌劑抗性試驗(yàn)，結(jié)果顯示M18菌株株易于清除，且對(duì)慶大霉

5、素和卡那霉素等較為敏感。因此，本章結(jié)果顯示和耐藥性均弱于近源高致病性菌株，提示不同環(huán)境進(jìn)化壓力對(duì)于銅綠假單胞不同菌株遺傳組成和表型的巨大作用。
　　 第三、采用定制DNA芯片技術(shù)，本文檢測(cè)了根際分離株M18和模式臨床分離株P(guān)AO1，在各自典型生境溫度下（根際溫度28℃、人體溫度37℃）的轉(zhuǎn)錄組變化情況。比較分析發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境條件對(duì)于銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)錄組影響明顯大于基因組，不同菌株在適應(yīng)非原環(huán)境條件時(shí)，調(diào)動(dòng)更多基因表達(dá)以適應(yīng)新環(huán)境條件

6、。此外，結(jié)果還顯示，根際來(lái)源菌株M18在土壤溫度下，22個(gè)基因組島中基因表達(dá)上調(diào)，但在人體環(huán)境溫度下，卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何基因組島中基因被誘導(dǎo)表達(dá)，提示附加基因組的表達(dá)對(duì)于細(xì)菌的環(huán)境適應(yīng)性具有重要影響。
　　 第四、序列分析發(fā)現(xiàn)，根際分離銅綠假單胞菌株M18附加基因組由5個(gè)基因島和兩個(gè)原噬菌體組成，缺少?zèng)Q定人體致病性輔基因島和噬菌體。M18菌株特有基因組島MGI-Ⅰ和MGI-Ⅱ分別含有一套含完整亞基的限制性修飾（RM）系統(tǒng)，在近源株沒(méi)

7、有發(fā)現(xiàn)完整RM系統(tǒng)，并且兩個(gè)菌株的附加基因組具有明顯差異。因此，本文首先試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因組島是可以環(huán)切出M18染色體，結(jié)合GC含量差異暗示這兩個(gè)基因組島為新近引入M18基因組中。隨后，敲除基因島上RM系統(tǒng)限制亞基基因后發(fā)現(xiàn)這些系統(tǒng)具有限制外源DNA通過(guò)轉(zhuǎn)化和接合方式進(jìn)入細(xì)胞的作用，證明這些RM系統(tǒng)具有限制外源遺傳物質(zhì)進(jìn)入的功能。這些結(jié)果提示RM基因組島對(duì)于M18菌株基因組結(jié)構(gòu)形成的重要功能，提示基因組島在M18菌株維持基因組穩(wěn)定，以適應(yīng)