嗜水氣單胞菌致病基因及Quorum Sensing調(diào)控Ⅲ型分泌系統(tǒng)的研究.pdf

1、嗜水氣單胞菌是一類能侵染動(dòng)物和人類的機(jī)會(huì)型致病菌，本研究采用LD<,50>法以藍(lán)色絲足魚為動(dòng)物模型來鑒定嗜水氣單胞分離菌的致病性，通過肌肉注射被測(cè)菌于魚的體內(nèi)并一個(gè)星期后觀察50﹪的致死量來定義該菌的致病性，致病菌定義為以藍(lán)色絲足魚為動(dòng)物模型其LD<,50>值≤10<'6.8>盤而非致病菌定義為L(zhǎng)D<,50>值>10<'7.4>，根據(jù)以上定義，本研究所用的菌株.PPD35/85、JCM3973、JCM3976、JCM3978、JCM39

2、80、JCM3983、JCM3985和JCM3996為非致病菌株，而PPD134/91則為致病菌株。 本研究從GenBank已收錄的三百多種單胞菌致病相關(guān)因子中篩選出34個(gè)致病因子，這些致病因子包括Ⅱ型和Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的毒性蛋白、胞外酶及毒素、結(jié)構(gòu)蛋白、調(diào)節(jié)蛋白及其他等，采用PCR方法從已知其LD<,50>值的21個(gè)致病菌和11個(gè)非致病菌中來篩選這34個(gè)致病基因，通過全面分析每個(gè)基因在這些分離菌中的分布來試圖找出存在區(qū)別病原菌

3、和非病原菌的特異基因；根據(jù)PCR結(jié)果，在34個(gè)致病基因當(dāng)中有20個(gè)致病基因(58.8﹪)普遍存在致病菌及非致病菌中(分布比例大于50﹪)，即alt，enolase，exeA，exeE,fliA，hlyA，hup，lip，ompⅡ, ompAl，opdA，pilt,pilU,pla，satA，serA，sodA，sodB，vgrG，and vhiP；采用Southern雜交分析發(fā)現(xiàn)多增加了四個(gè)普遍存在的致病基因(chiA，mgtE，fla

4、A and mepA)使其分布百分比達(dá)到至少70.6﹪以上，這進(jìn)一步表明嗜水氣單胞菌致病機(jī)制的多元性本質(zhì)；另一方面，根據(jù)PCR結(jié)果的開方試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)8個(gè)基因(aexT, alt，exeA，chiA，hlyA，hup，satA and yhiP)在致病和非致病群中的分布是很明顯的(P<0.05)，5個(gè)基因介于明顯分界線(0.05

5、少分布在非致病菌中(小于30﹪)，且這兩類群體之間的差值大于30﹪，Southem blot分析確證了aexT和lafA而不是chiA或mepA可作為鑒定表型的候選基因，我們的研究結(jié)果提供了兩個(gè)供快速、特異的檢測(cè)致病性嗜水氣單胞菌的候選基因，將有助于通過適宜和有效的治療法加速對(duì)嗜水氣單胞菌感染的控制。 采用基因組步移法獲得了嗜水氣單胞菌AH-1 quorum sensing(簡(jiǎn)稱QS)兩個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因ahyI、ahyR的全序列，

6、并根據(jù)該序列構(gòu)建了嗜水氣單胞菌AH-1 QS兩個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因ahyI、ahyR的突變菌株，隨后測(cè)定了野生型及突變型菌株的生物膜的形成，并利用指示菌檢測(cè)信號(hào)分子C4-AHL的合成情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了已經(jīng)成功構(gòu)建了缺失合成信號(hào)分子C4-AHL的ahyI的突變株；通過SDS-PAGE和二維電泳來全面分析QS突變株對(duì)嗜水氣單胞菌分泌胞外蛋白的影響發(fā)現(xiàn)，ahyR突變株分泌胞外蛋白的水平與野生型相比無明顯變化，而缺失ahyI基因的突變株胞外蛋白表達(dá)

7、水平顯著降低，初步證明了OS系統(tǒng)信號(hào)分子合成基因ahyI對(duì)嗜水氣單胞菌致病性有重要影響，接著利用鯉魚上皮瘤乳頭細(xì)胞(EPC)作為宿主研究其突變株對(duì)宿主的侵染性影響，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明缺失信號(hào)分子合成基因ahyI的突變株對(duì)宿主的侵染性明顯減弱，而缺失調(diào)節(jié)基因ahyR的突變株與野生型菌株相比對(duì)宿主的侵染性無明顯差異，再次驗(yàn)證了QS合成信號(hào)分子ahyI基因?qū)κ人畾鈫伟虏⌒杂兄匾绊憽?首次利用嗜水氣單胞菌AH-1 QS兩個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因

8、ahyI、ahyR的突變菌株來分析Os對(duì)嗜水氣單胞菌AH-1 Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因的表達(dá)影響，以期找出它們之間的關(guān)聯(lián)；采用PCR的方法特異性擴(kuò)增TTSS基因啟動(dòng)子區(qū)域，用EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切并連接到同樣經(jīng)過EcoRI和BamHI酶切的載體pRW50上構(gòu)建LacZ報(bào)告質(zhì)粒，檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性來研究QS對(duì)Ⅲ型分泌系統(tǒng)的影響，結(jié)果顯示ahyI突變株中TTSS基因的表達(dá)量與野生型相比明顯提高，初步闡明了TTSS基因的表達(dá)受QS系統(tǒng)的