嗜水氣單胞菌分離鑒定、分型及環(huán)境因子影響的研究.pdf

1、嗜水氣單胞菌可引起鯽、團(tuán)頭魴、鰱和鯉等多種魚(yú)類感染細(xì)菌性敗血癥，給魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)細(xì)菌進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，才能方便進(jìn)行后續(xù)的研究以及疾病的防控。在細(xì)菌常規(guī)鑒定中，一般的方法是細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鑒定并輔以生化試驗(yàn)。由于細(xì)菌作為單細(xì)胞生物，具有多態(tài)性、易變異，某些生化反應(yīng)不穩(wěn)定等原因，僅依靠形態(tài)和生化反應(yīng)難以準(zhǔn)確鑒定。因此尋求其他準(zhǔn)確、快捷的細(xì)菌鑒定方法具有重要意義。目前原核生物的16S rDNA序列分析已成為細(xì)菌種屬鑒定和分類的標(biāo)

2、準(zhǔn)方法。
　　本實(shí)驗(yàn)從不同地域發(fā)病池塘的不同生態(tài)位分離細(xì)菌，綜合細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、分子鑒定、生理生化測(cè)定，以及構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和同源性的分析對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。生理生化特征顯示為能分解利用甘露糖、蔗糖、枸櫞酸鹽、丙二酸鹽、尿素、膽汁七葉苷等，不發(fā)酵松三糖、蜜二糖、肌醇等，發(fā)酵型，葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。對(duì)菌株W J11-5基因序列測(cè)序結(jié)果顯示16S rRNA基因長(zhǎng)度為1450 bp，在GenBank的登錄號(hào)為：JN836334，將菌株所

3、擴(kuò)增的基因序列在NCBI通過(guò)Blast進(jìn)行同源性檢索，并采用鄰接法構(gòu)建菌株分子發(fā)育樹(shù)，分離菌株16S rRNA基因在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上與嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)(登錄號(hào)：JF826531)聚為一支，同源性達(dá)99％以上。最終確定本實(shí)驗(yàn)中分離到的細(xì)菌為嗜水氣單胞菌(A. hydrophila)。
　　對(duì)采集自江蘇、河南、福建等地淡水養(yǎng)殖區(qū)域的105株嗜水氣單胞菌(A. hydrophila)進(jìn)行了基因分型，探

4、討嗜水氣單胞菌的基因型與區(qū)域分布及生態(tài)位的關(guān)聯(lián)性。本實(shí)驗(yàn)以腸道細(xì)菌基因間重復(fù)共有序列PCR（ERIC-PCR）技術(shù)進(jìn)行分型，應(yīng)用 Quantity one4.6對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析，采用非加權(quán)配對(duì)法(UPGMA法)做遺傳分析的樹(shù)狀圖。結(jié)果表明，105株嗜水氣單胞菌可分為28個(gè)基因型。其中，XV基因型的菌株相對(duì)最多，IV, XI, XXII, XXV, XXVIII, XXVII, XXVI基因型的菌株相對(duì)最少。生態(tài)位背景來(lái)源相似的菌株有聚

5、類趨勢(shì)。此外，不同地域、不同生態(tài)位的嗜水氣單胞菌也可能聚為同一種基因型。由此推斷嗜水氣單胞菌的基因型可能與生態(tài)位及地理位置有一定的關(guān)聯(lián)性。
　　選擇團(tuán)頭魴為試驗(yàn)魚(yú)體，將分離出的105株嗜水氣單胞菌進(jìn)行人工回感實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證它們致病力的強(qiáng)弱。選出毒性最強(qiáng)的菌株做環(huán)境脅迫實(shí)驗(yàn)，研究環(huán)境脅迫因子和嗜水氣單胞菌菌株致病力之間的關(guān)系。采用正交設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)一個(gè)4水平因素（溫度）和三個(gè)2水平因素（pH、亞硝酸鹽、氨氮）的實(shí)驗(yàn)。模擬池塘養(yǎng)殖環(huán)境，分析

6、顯著影響菌體致病力的因素，并建立了魚(yú)體存活時(shí)間與環(huán)境因子的回歸方程y=164.713-6.399A+14.367B-11.914B×C；式中，y為魚(yú)體存活時(shí)間以小時(shí)為單位。A（溫度）的取值范圍是20-32℃，B（pH）的取值范圍是6.5-8，C（分子氨）的取值范圍是0.02-0.04 mg/L。結(jié)果顯示溫度、氨氮與pH的交互作用對(duì)魚(yú)體存活長(zhǎng)短的影響極其顯著；pH單獨(dú)的脅迫作用顯著；亞硝酸鹽的脅迫作用不顯著。當(dāng)溫度為20℃，pH=8，分子