嗜水氣單胞菌非質(zhì)粒依賴性菌蛻疫苗的研制及評(píng)價(jià).pdf

1、嗜水氣單胞菌在自然界中分布廣泛，由致病性嗜水氣單胞菌引起的疾病在世界海、淡水養(yǎng)殖中也普遍存在，給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來(lái)了巨大損失，如何對(duì)其所致的各類疾病進(jìn)行有效控制一直為研究者所重視。
　　 菌蛻是革蘭氏陰性菌被噬菌體phiX174的裂解基因E裂解后所形成的不含胞質(zhì)內(nèi)含物的完整細(xì)菌空殼。由于保留了細(xì)菌原有的表面結(jié)構(gòu)和特性，因此是一種比常規(guī)疫苗更理想的新型疫苗體系。當(dāng)前菌蛻疫苗的制備均是通過(guò)轉(zhuǎn)化攜帶有裂解基因E及其控制單元的質(zhì)粒并誘導(dǎo)其表達(dá)

2、而完成，存在潛在抗性基因擴(kuò)散及由于殘存活菌所致的安全問(wèn)題。
　　 為解決以上問(wèn)題，本研究通過(guò)將裂解基因E及其控制單元整合進(jìn)嗜水氣單胞菌染色體的aroA基因內(nèi)，構(gòu)建出兼具減毒特性的菌蛻疫苗制備候選突變株，具有更高的安全性。
　　 1.嗜水氣單胞菌疫苗候選菌株的驗(yàn)證
　　 通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、選擇性培養(yǎng)基篩選、生理生化分析及16S rDNA和gyrB序列測(cè)定等方法對(duì)本室保存的一株分離自患出血性敗血癥鯽魚(yú)的細(xì)菌J-1進(jìn)行驗(yàn)

3、證，證明該細(xì)菌為嗜水氣單胞菌。人工感染實(shí)驗(yàn)顯示該細(xì)菌具有致病性，對(duì)異育銀鯽的半數(shù)致死量為1.2×106 CFU。
　　 2.基于pR/pL分別啟動(dòng)裂解基因E和核酸酶A基因共表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 菌蛻是一種新的疫苗平臺(tái)，它的安全高效生產(chǎn)主要依賴于合適的功能載體。本研究中，我們構(gòu)建了一系列含phiX裂解基因E和/或核酸酶A的溫控質(zhì)粒并在大腸桿菌中進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，核酸酶A的直接產(chǎn)物(pBV220-SNA)可以降解質(zhì)粒及大

4、腸桿菌的基因組，而基因E和部分Cro基因的融合產(chǎn)物(pKF396M-2)則不能裂解宿主菌。通過(guò)在兩者間插入增強(qiáng)子元件T7g10和SD盒(pKF396M-3)可以恢復(fù)基因E的功能。利用基于pR/pL分別啟動(dòng)裂解基因E和核酸酶A基因的共表達(dá)載體pKF396M-4，殘留質(zhì)粒及大腸桿菌基因組被清除，滅活效率較單純使用E介導(dǎo)的裂解質(zhì)粒要高2個(gè)數(shù)量級(jí)。將基因E和SNA用設(shè)計(jì)合成的多克隆位點(diǎn)替換即構(gòu)建成具有兩個(gè)多克隆位點(diǎn)的雙表達(dá)載體pKF396M-5

5、。
　　 3.嗜水氣單胞菌aroA無(wú)標(biāo)記缺失突變株的構(gòu)建及其特性
　　 克隆嗜水氣單胞菌J-1株aroA基因及其上下游序列，最終測(cè)序拼接出長(zhǎng)度為3704bp的核苷酸序列，該序列與嗜水氣單胞菌ATCC7966同源性相似度最高，達(dá)97％。在此基礎(chǔ)上重新設(shè)計(jì)合成兩對(duì)引物分別擴(kuò)增出aroA基因上下游1200bp左右的序列，酶切后連入經(jīng)多克隆位點(diǎn)置換改造的自殺質(zhì)粒pDS132，構(gòu)建出含缺失1103bp aroA基因的重組自殺質(zhì)粒，

6、將其接合轉(zhuǎn)導(dǎo)至嗜水氣單胞菌J-1，通過(guò)2次同源重組及PCR鑒定篩選出aroA無(wú)抗性標(biāo)記缺失株，該嗜水氣單胞菌aroA缺失株能在LB固體培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基Rimler-Shoots瓊脂上和鑒別性培養(yǎng)基AHM瓊脂平板上正常生長(zhǎng)，呈現(xiàn)的形態(tài)特征也與J-1株類似，但在LB液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度則較J-1為慢。在所測(cè)試的15項(xiàng)生理生化反應(yīng)指標(biāo)中，僅VP反應(yīng)指標(biāo)一項(xiàng)與與J-1株不同，為陰性，胞外蛋白酶活性檢測(cè)呈陽(yáng)性，對(duì)異育銀鯽的LD50為2.8×

7、108 CFU。
　　 4.基于染色體裂解基因E介導(dǎo)的嗜水氣單胞菌菌蛻疫苗的制備
　　 利用同源重組技術(shù)將裂解基因E及其控制單元整合進(jìn)嗜水氣單胞菌染色體的aroA基因內(nèi)，并通過(guò)升溫誘導(dǎo)裂解基因E表達(dá)成功制備出非質(zhì)粒依賴性菌蛻疫苗。溶菌動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)顯示，在誘導(dǎo)后的1h內(nèi)，其OD600快速上升，但2h后OD600開(kāi)始持續(xù)下降，6h后開(kāi)始趨于平穩(wěn)，此時(shí)培養(yǎng)物活菌數(shù)從誘導(dǎo)前的6.4×107CFU/mL下降至1.7×102CFU/m

8、L，下降了105倍。掃描電鏡觀察可見(jiàn)絕大部分菌體經(jīng)誘導(dǎo)后形成菌蛻，跨膜通道位于細(xì)胞中央或兩端。
　　 5.嗜水氣單胞菌菌蛻疫苗對(duì)異育銀鯽的免疫保護(hù)
　　 于27.2℃～29.8℃水溫下，分別用菌蛻疫苗(AHG)、福爾馬林全菌滅活疫苗(FKC)和PBS通過(guò)腹腔注射免疫異育銀鯽，比較其免疫效果。結(jié)果顯示，AHG免疫組血清凝集指數(shù)(1∶277.3)高于FKC免疫組(1∶170.7)和PBS免疫組(1∶9.6)，對(duì)同源菌也顯示出