PDGF-PDGFR在原發(fā)性血小板增多癥中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　檢測(cè)原發(fā)性血小板增多癥患者PDGF及PDGFR的表達(dá)水平，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察增高的PDGF水平對(duì)血小板生成的影響，明確其在ET發(fā)病中的作用;進(jìn)一步探索PDGF/PDGFR于ET發(fā)病中的分子機(jī)制;并以PDGFR為靶點(diǎn)，探索酪氨酸酶抑制劑，伊馬替尼對(duì)ET的治療作用。
　　方法：
　　一、檢測(cè)ET患者PDGF-BB及PDGFR-β的表達(dá)水平
　　1、研究對(duì)象
　　研究對(duì)象為2012年5月到2014年4

2、月因外周血血小板增多(血小板＞450×109/L)就診于本研究單位，通過骨穿結(jié)果，分子生物學(xué)結(jié)果，排除繼發(fā)性血小板增多，診斷為原發(fā)性血小板增多癥的患者;對(duì)照組為本單位造血干細(xì)胞移植健康供者。
　　2、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)ET患者及正常人骨髓血清PDGF-BB表達(dá)
　　標(biāo)本來源于骨髓，用EDTA抗凝管收集標(biāo)本后，600g離心15 min，分離上清液凍存于-80℃冰箱，統(tǒng)一檢測(cè)。將標(biāo)本和試劑盒于室溫解凍，根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道人血清中P

3、DGF-BB濃度，用PBS將標(biāo)本稀釋5倍;所有標(biāo)本一式3份加樣;加樣后室溫震蕩孵育2.5 h，清洗后加抗體室溫震蕩孵育1h后清洗，加顯色劑后，于酶標(biāo)儀顯色，讀取吸光度。
　　3、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)ET患者PDGFR-β的表達(dá)
　　來源于骨髓的標(biāo)本收集血清后，剩余細(xì)胞用溶血液溶解紅細(xì)胞后，離心，用PBS洗滌兩遍，剩余細(xì)胞為用PBS重懸使細(xì)胞濃度為1×107/ml，加入CD140b-PE20μl/100μl，室溫避光溫孵育30 m

4、in后洗滌，重懸于PBS，每管取1×106個(gè)細(xì)胞，上機(jī)。
　　二、體內(nèi)觀察PDGF-BB對(duì)小鼠血小板生成的影響
　　取6-8周齡的雌性Balb/c小鼠16只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control組，生理鹽水腹腔注射)，PDGF組(PDGF，1.5ug/kg/d)，imatinib組(imatinib，50mg/kg/d)，PDGF+imatinib組(PDGF，1.5ug/kg/d+ imatinib，50mg/kg/d)，每

5、組4只，連續(xù)21天按照分組分別通過腹腔注射給予PDGF因子，灌飼伊馬替尼。分別于第0、7、21天檢測(cè)各組小鼠外周血象。
　　三、PDGF-BB促血小板生成的分子機(jī)制
　　1、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)PDGF-BB對(duì)巨核細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路活化的影響
　　巨核細(xì)胞株CHRF-288用完全培養(yǎng)基（10％胎牛血清+1640培養(yǎng)基）培養(yǎng);分為對(duì)照組、PDGF組、伊馬替尼組、PDGF+伊馬替尼組。實(shí)驗(yàn)前，CHRF-288細(xì)胞

6、用低血清培養(yǎng)基（1％胎牛血清+1640培養(yǎng)基）饑餓一晚，對(duì)應(yīng)組別，分別加入伊馬替尼(5 mmol/L)，置于孵箱中（5％二氧化碳，37度）孵育1h后，對(duì)應(yīng)分別加入PDGF-BB(200ng/ml)，孵箱中孵育30-60 min后收集各組細(xì)胞。在各組細(xì)胞中分別加入4％多聚甲醛，固定細(xì)胞10 min后，加入破膜液，置于冰上冰孵30 min。細(xì)胞破膜后，收集并清洗各組細(xì)胞，各組細(xì)胞對(duì)應(yīng)加入P-JAK2、P-STAT3抗體，常溫孵育30-60

7、min后，洗滌，PBS重懸，上機(jī)。
　　2、Western blot檢測(cè)PDGF-BB對(duì)巨核細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的影響
　　巨核細(xì)胞株CHRF-288用完全培養(yǎng)基（10％胎牛血清+1640培養(yǎng)基）培養(yǎng);分為對(duì)照組、PDGF組、伊馬替尼組、PDGF+伊馬替尼組。實(shí)驗(yàn)前，CHRF-288細(xì)胞用低血清培養(yǎng)基（1％胎牛血清+1640培養(yǎng)基）饑餓一晚，對(duì)應(yīng)組別，分別加入伊馬替尼(5 mmol/L)，置于孵箱中（5％二氧化碳，3

8、7度）孵育1h后，對(duì)應(yīng)分別加入PDGF-BB(200ng/ml)，孵箱中孵育30-60 min后收集各組細(xì)胞。提取蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，并調(diào)整蛋白濃度使得每孔加入等量蛋白樣品。加入蛋白樣品后，進(jìn)行凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫封閉2h，孵育抗體，洗膜，用化學(xué)發(fā)光底物試劑檢測(cè)蛋白條帶，讀取條帶。
　　四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對(duì)于連續(xù)型變量，首先進(jìn)行正態(tài)性分布檢驗(yàn)，對(duì)于

9、符合正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組計(jì)量資料的均值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素的方差分析(one-way ANOVA);對(duì)于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，兩組間均值比較采用秩和檢驗(yàn)，Mann-Whitney檢驗(yàn)方法;多組之間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn);當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、ET患者PDGF-BB及PDGFR-β的表達(dá)
　　1、E

10、T患者骨髓PDGF-BB表達(dá)
　　用ELISA方法共檢測(cè)了原發(fā)性血小板增多癥患者(n=16)和正常對(duì)照組(n=8)血清PDGF-BB表達(dá)水平。根據(jù)吸光度算出ET患者和正常對(duì)照組骨髓血清PDGF-BB濃度。原發(fā)性血小板增多癥患者骨髓血清中PDGF-BB濃度為2070.92±123.98 pg/ml，顯著高于正常組對(duì)照組(1381.85±128.37pg/ml)(P=0.002)。
　　2、ET患者骨髓細(xì)胞PDGFR-β的表達(dá)<

11、br>　　通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)ET患者和正常對(duì)照組骨髓細(xì)胞PDGFR-β的表達(dá)。ET患者(圖2B) PDGFR-β的表達(dá)顯著高于正常人;共檢測(cè)了ET患者(n=6)和正常人(n=3)。首先對(duì)各組比較結(jié)果進(jìn)行Levene檢驗(yàn)，方差不齊，F(xiàn)=8.824，P=0.021;組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)ET患者骨髓細(xì)胞中PDGFR-β的表達(dá)顯著高于對(duì)照組骨髓細(xì)胞的表達(dá)(P=0.02)。
　　二、體內(nèi)觀察PDGF-BB對(duì)小

12、鼠血小板生成的影響
　　1、PDGF-BB對(duì)小鼠外周血的影響
　　實(shí)驗(yàn)前，各組小鼠血小板數(shù)目無明顯差異。21天時(shí)，PDGF組小鼠血小板數(shù)目明顯高于正常對(duì)照組(537±15×109/L vs454±9×109/L，n=4，P=0.006).說明在小鼠體內(nèi)，高濃度的PDGF-BB可以顯著促進(jìn)小鼠血小板的生成，使血小板異常升高，可能是ET發(fā)病的機(jī)制之一。為了進(jìn)一步研究PDGF-BB促進(jìn)小鼠血小板升高是否是通過PDGFR，我們用伊馬

13、替尼灌飼PDGF-BB高水平小鼠，并比較其血小板水平與高濃度PDGF組小鼠血小板水平的差異。發(fā)現(xiàn)在21天時(shí)，伊馬替尼聯(lián)合PDGF組小鼠的血小板數(shù)目顯著低于PDGF組(424±25×109/L vs537±15×109/L，n=4，P=0.001)，而伊馬替尼組小鼠較正常組小鼠血小板無明顯變化。說明，PDGF的促血小板生成作用是通過作用于PDGFR，而伊馬替尼可以有效得阻斷該作用。實(shí)驗(yàn)前和21天時(shí)各組小鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞數(shù)目無明顯差異，說明

14、升高的PDGF水平選擇性得對(duì)血小板有升高作用，而對(duì)白細(xì)胞和紅細(xì)胞并無作用。
　　2、小鼠骨髓病理切片
　　21天后，將各組小鼠全部處死后進(jìn)行骨髓組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)各組小鼠紅系和粒系增生程度無明顯差異，但PDGF組小鼠骨髓組織巨核細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組;而與PDGF組相比，PDGF聯(lián)合imatinib組小鼠骨髓組織中巨核細(xì)胞明顯減少，并且退化及凋亡的巨核細(xì)胞明顯增多。綜上所述，小鼠骨髓病理結(jié)果與小鼠外周血結(jié)果相一致，PDGF處理組

15、小鼠骨髓巨核系增生活躍，導(dǎo)致外周血小板升高，而加入imatinib后，可以阻斷PDGF/PDGFR對(duì)巨核系的促增殖作用，并促進(jìn)巨核細(xì)胞的凋亡，從而有效阻斷PDGF對(duì)小鼠外周血小板的促生成作用。
　　三、PDGF-BB對(duì)巨核細(xì)胞JAK2/STAT3、PI3K/AKT信號(hào)通路的影響
　　1、PDGF-BB對(duì)巨核細(xì)胞JAK2/STAT3、PI3K/AKT信號(hào)通路的影響
　　JAK2/STAT3、PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)巨核

16、細(xì)胞的增殖、分化和成熟有重要作用。分別用流式細(xì)胞技術(shù)和Werstern blot技術(shù)探究PDGF-BB對(duì)巨核細(xì)胞JAK2/STAT3、PI3K/AKT信號(hào)通路活化的影響。PDGF-BB可以使CHRF-288細(xì)胞株P(guān)-JAK2、P-STAT3、P-AKT蛋白表達(dá)增加，說明PDGF-BB可以激活巨核細(xì)胞JAK2/STAT3、PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。為了進(jìn)一步證明PDGF-BB通過PDGFR作用于巨核細(xì)胞，加入

17、PDGFR阻斷劑伊馬替尼，發(fā)現(xiàn)伊馬替尼可以使PDGF-BB對(duì)巨核細(xì)胞JAK2/STAT3、PI3K/AKT信號(hào)通路的作用減弱。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)ET患者骨髓中PDGF-BB、PDGFR-β表達(dá)顯著升高;且升高的PDGF-BB能有效升高小鼠外周血血小板數(shù)目，而伊馬替尼可以有效得阻斷該作用;PDGF-BB能促進(jìn)巨核細(xì)胞JAK2/STAT3、PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，而伊馬替尼能有效阻斷PDGF-BB對(duì)巨核細(xì)胞信號(hào)

18、通路的活化作用。因此，我們推斷ET患者骨髓中升高的PDGF-BB和PDGFR-β通過激活巨核細(xì)胞JAK2/STAT3、PI3K/AKT信號(hào)通路的活化，促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖，并抑制其凋亡，進(jìn)而促進(jìn)血小板的生成和釋放，可能是ET發(fā)病的機(jī)制之一;酪氨酸激酶抑制劑，伊馬替尼通過作用于PDGFR，有效阻斷PDGF-BB對(duì)巨核細(xì)胞JAK2/STAT3、PI3K/AKT信號(hào)通路的促活化作用，從而抑制PDGF-BB對(duì)巨核細(xì)胞/血小板的促生成作用，可能對(duì)ET