肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗低氧聯(lián)合腫瘤壞α誘導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的研究.pdf

1、第一部分低氧聯(lián)合腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型的建立
　　目的：明確低氧聯(lián)合腫瘤壞死因子α（TNF-α）復(fù)合刺激對(duì)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HPMVEC）凋亡的影響，從而建立低氧聯(lián)合TNF-α誘導(dǎo)HPMVEC凋亡的細(xì)胞模型。
　　方法：
　　1、HPMVEC的體外培養(yǎng)：采用懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞的離心傳代法進(jìn)行傳代培養(yǎng)，收集第4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　2、實(shí)驗(yàn)分組、MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活力：分為空白對(duì)照組、低氧組（低

2、氧6h、12h、24h）及TNF-α組（10、20、50、100ng/ml），使用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活力。
　　3、丙二醛（MDA）含量及乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、半胱天冬酶-3（caspase-3）的活性檢測(cè)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確立空白對(duì)照組、低氧24小時(shí)組、TNF-α100ng/ml及低氧24小時(shí)+TNF-α100ng/ml組，檢測(cè)各組上清液的MDA含量及LDH、SOD、caspase-3的活性。
　

3、　4、采用ANNEXIN V-PI及TUNEL法檢測(cè)HPMVEC凋亡率。
　　結(jié)果：
　　1、MTT比色法檢測(cè)的細(xì)胞活力：與空白對(duì)照組相比，在低氧組中，低氧24小時(shí)組相對(duì)細(xì)胞活力更低，而TNF-α組中，TNF-α100ng/ml組的相對(duì)細(xì)胞活力更低，且TNF-α對(duì)細(xì)胞活力的抑制與TNF-α濃度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。根據(jù)以上結(jié)果，最終選擇了低氧24小時(shí)及 TNF-α100ng/ml作為聯(lián)合干預(yù)組。與低氧24小時(shí)、TNF-α100n

4、g/ml單獨(dú)作用組相比，聯(lián)合干預(yù)組的相對(duì)細(xì)胞活力（65.93％±1.87%）更低。
　　2、MDA含量和 LDH、SOD及 caspase-3的活性檢測(cè)：低氧24小時(shí)+TNF-α100ng/ml聯(lián)合干預(yù)組的 MDA含量（16.91±0.54） nmol/ml、LDH（5149.05±152.61）U/L及caspase-3活性（25.39%±0.72%）升高而SOD活性（4.40±0.33）U/ml降低，與低氧24小時(shí)及TNF-α

5、100ng/ml單獨(dú)作用組相比，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、細(xì)胞凋亡檢測(cè)：低氧24小時(shí)+TNF-α聯(lián)合干預(yù)組細(xì)胞凋亡率（25.53%±0.94%）及凋亡指數(shù)（86.00%±1.06%）增加更為明顯，與低氧24小時(shí)及TNF-α100ng/ml單獨(dú)作用組相比，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；且低氧+TNF-α聯(lián)合干預(yù)組呈協(xié)同促凋亡效應(yīng)。
　　結(jié)論：低氧聯(lián)合TNF-α復(fù)合刺激對(duì)HPMVEC產(chǎn)生協(xié)同促凋亡效應(yīng)。
　　第二部分肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗

6、低氧聯(lián)合腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡機(jī)制信號(hào)通路的探討
　　目的：明確肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）抗低氧聯(lián)合TNF-α誘導(dǎo)HPMVEC凋亡的信號(hào)通路
　　方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)分組：參照第一部分模型建立的基礎(chǔ)以及細(xì)胞培養(yǎng)的方法，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、模型組（低氧24小時(shí)+TNF-α100ng/ml）、干預(yù)組（HGF100ng/ml+低氧24小時(shí)+TNF-α100ng/ml）分別進(jìn)行培養(yǎng)。
　　2、Wester

7、n blot：對(duì)各實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞進(jìn)行磷酸化通路蛋白(pAKT、p-P38MAPK、pERK1/2、pSTAT3）的Western blot檢測(cè)。并根據(jù)結(jié)果，增加相關(guān)通路的阻斷劑或激動(dòng)劑組。
　　3、Caspase-3的活性檢測(cè)：方法與第一部分相同。
　　4、ANNEXIN V-PI法和TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：根據(jù)Western blot檢測(cè)結(jié)果，各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1、Western b

8、lot檢測(cè)：與空白對(duì)照組相比，模型組磷酸化蛋白激酶B（pAKT）表達(dá)下降、磷酸化P38絲裂原活化蛋白激酶（p-P38MAPK）（1.75±0.25,P=0.04）及磷酸化細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子3（pSTAT3）（3.16±0.63,P=0.03）表達(dá)升高；與模型組相比，干預(yù)組pAKT表達(dá)上調(diào)，而p-P38MAPK及pSTAT3表達(dá)下降，但并不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（pERK1/2）在各實(shí)驗(yàn)組間均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差

9、異。根據(jù)上述磷酸化蛋白表達(dá)情況，選擇加入PI3K通路阻斷劑LY294002，發(fā)現(xiàn)pAKT的表達(dá)再次下降（0.69±0.04），與干預(yù)組相比，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、Caspase-3的活性檢測(cè)：與模型組對(duì)比，干預(yù)組 caspase-3的活性明顯下降，而加入了PI3K通路阻斷劑LY294002后， caspase-3的活性再次升高。
　　3、細(xì)胞凋亡檢測(cè)：與模型組對(duì)比，干預(yù)組細(xì)胞凋亡率及凋亡指數(shù)（36.60%±1.22%）下