人RPP蛋白對丙肝病毒復(fù)制的負(fù)調(diào)控作用的研究.pdf

1、目的：
　　本文擬通過制備人源化的RPP蛋白，并研究其與HCV5'UTR在體外的結(jié)合活性。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討宿主細(xì)胞RPP蛋白對HCV增殖的影響。
　　方法與結(jié)果：
　　全文共分兩大部分：一、人源化RPP蛋白與HCV5'UTR體外結(jié)合的研究。首先構(gòu)建重組RPP基因的慢病毒載體，將其轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞包裝慢病毒并感染HEK293細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀分選，成功獲得四種穩(wěn)定表達(dá)人RPP蛋白的細(xì)胞系（分別是Rpp20、

2、Rpp21、Rpp25和Rpp29）。進(jìn)一步將上述細(xì)胞系擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)Bio-Rad蛋白純化儀純化及SDS聚丙烯酰胺電泳鑒定，結(jié)果四種RPP蛋白都有表達(dá)且純度較好。此外，通過體外32P-UTP參入的體外轉(zhuǎn)錄，制備同位素標(biāo)記的HCV5'UTR（nt1-341）作為靶RNA片段，通過EMSA試驗檢測人源化的RPP與靶RNA的體外結(jié)合活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四種RPP均可與HCV5'UTR直接結(jié)合，其中Rpp20結(jié)合力相對較弱，而Rpp29的結(jié)合力則最

3、強(qiáng)。二、宿主細(xì)胞RRP蛋白對HCV增殖的影響。將構(gòu)建的四種RPP基因慢病毒分別感染Huh7.5.1細(xì)胞，以上調(diào)細(xì)胞RPP蛋白的表達(dá)，再感染HCV病毒。通過熒光定量PCR測定感染細(xì)胞及上清中HCV的滴度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述RPP蛋白的過表達(dá)均可顯著抑制HCV病毒的增殖，其中Rpp29蛋白的抑制作用最強(qiáng)。與此同時，通過RNA干擾技術(shù)(RNAi)分別沉默宿主細(xì)胞中上述四種RPP蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rpp20的沉默對HCV的增殖無明顯影響，而Rpp