狂犬病病毒P蛋白與宿主RPL9的相互作用及其調(diào)控病毒復(fù)制的研究.pdf

1、狂犬病是一種人或其他溫血?jiǎng)游锏牟《拘阅X脊髓炎，在家畜和野生動(dòng)物之間可以自然感染與傳播，感染后一旦出現(xiàn)臨床癥狀，致死率幾乎100％。其病原體是彈狀病毒科狂犬病毒屬的狂犬病毒（Rabies virus，RABV）?？袢《居梢粭l單股負(fù)鏈RNA和五種結(jié)構(gòu)蛋白組成，其中磷酸化蛋白P作為一種多功能的非催化活性蛋白，在病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。迄今為止，雖然有研究表明狂犬病病毒P蛋白既能與其自身的結(jié)構(gòu)蛋白相互作用，又能與宿主細(xì)胞的某些蛋白

2、互作，并參與病毒的生活周期調(diào)控，但這方面的研究還相當(dāng)有限，狂犬病毒的致病機(jī)致仍未完全闡明。本研究通過噬菌體展示技術(shù)，篩選出與狂犬病毒P蛋白相互作用的宿主核糖體蛋白L9，對(duì)其進(jìn)行了體內(nèi)、外驗(yàn)證，并深入研究了其對(duì)病毒復(fù)制的影響，為進(jìn)一步闡明狂犬病毒的復(fù)制和致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　1、RABV-P宿主相互作用蛋白的篩選
　　為了進(jìn)一步了解狂犬病毒的致病機(jī)制，探索P蛋白的生物學(xué)功能，首先從狂犬病毒cDNA中擴(kuò)增并克隆了P基因，利用大

3、腸桿菌表達(dá)并純化了P蛋白;進(jìn)一步通過人腦T7噬菌體展示技術(shù)，經(jīng)過五輪篩選，用ELISA，BLAST對(duì)比和讀碼框校對(duì)等確定了13種與P蛋白相互作用的候選蛋白。
　　2、L9與P蛋白相互作用的驗(yàn)證
　　為了驗(yàn)證13種候選蛋白是否與P蛋白直接相互作用，構(gòu)建了所有候選基因與GST標(biāo)簽的融合表達(dá)質(zhì)粒，利用原核表達(dá)并純化了相關(guān)融合蛋白。DOT-pull-down試驗(yàn)表明L9與RABV-P有明顯的相互作用。通過GST-pull-down試

4、驗(yàn)證明L9與RABV-P在體外可以直接相互作用。為了排除體外非特異的環(huán)境造成假陽(yáng)性的結(jié)果，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了L9與P蛋白，通過Co-IP試驗(yàn)進(jìn)一步證明RABV-P蛋白與L9相互作用。
　　P蛋白與L9在細(xì)胞的什么部位相互作用？為了回答這個(gè)問題，構(gòu)建了P融合綠色熒光蛋白GFP和L9融合表達(dá)紅色熒光蛋白DsRed的真核表達(dá)質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)HEK-293T細(xì)胞，共聚焦熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示P蛋白招募大多數(shù)細(xì)胞核中的L9蛋白共定位于細(xì)胞質(zhì)中，顯示P

5、與L9在細(xì)胞質(zhì)中有相互作用的可能。為了進(jìn)一步確證以上結(jié)果在自然狀態(tài)下能否發(fā)生，用RABV感染HEK-293T細(xì)胞，間接免疫熒光試驗(yàn)顯示L9與P蛋白仍然共定位于細(xì)胞質(zhì)
　　3、L9與P蛋白相互作用區(qū)域的確定
　　為了確定L9與P蛋白的相互作用位點(diǎn)，利用pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一系列研究。首先，將P基因做了P19-297、P52-297、P82-297、P138-297、P172-297、P1-137、P1-180 andP

6、1-218等8個(gè)截短，并分別表達(dá)、純化相應(yīng)蛋白，然后與帶有GST標(biāo)簽的L9蛋白進(jìn)行GST-pull-down試驗(yàn)，結(jié)果顯示L9與P蛋白的138位至180位氨基酸區(qū)域相互作用。為了確證這一結(jié)果，我們構(gòu)建了缺失該區(qū)域的表達(dá)質(zhì)粒(PΔ138-180)，通過類似的方法證明PΔ138-180蛋白不能與P蛋白結(jié)合，進(jìn)一步驗(yàn)證了前面的結(jié)果。為了確定P蛋白在L9蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)L9蛋白結(jié)構(gòu)，我們構(gòu)建并表達(dá)了L91-39、 L91-61、L91-8

7、5、L962-192、 L986-192和L997-192等6個(gè)截短突變體。His-pull-down結(jié)果表明L9的N端39個(gè)氨基酸與P蛋白的相互作用無關(guān)。
　　4、L9對(duì)RABV生物學(xué)功能的研究
　　在細(xì)胞水平上過表達(dá)L9，通過檢測(cè)RABV報(bào)告基因的表達(dá)水平研究L9對(duì)病毒復(fù)制的影響，結(jié)果表明過表達(dá)L9能夠顯著抑制RABV的復(fù)制（10-20倍）;western-blot的結(jié)果顯示P蛋白的表達(dá)量較對(duì)照下降了60-70％。為了進(jìn)

8、一步確證L9抑制RABV的復(fù)制是否具有特異性，在過表達(dá)L9的條件下測(cè)定了VSV的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示VSV的復(fù)制與對(duì)照沒有顯著差異。以上結(jié)果表明L9過表達(dá)能特異性地抑制RABV的復(fù)制。
　　那么降低L9的表達(dá)或敲除L9對(duì)RABV的情況會(huì)是怎樣呢？為了回答這個(gè)問題，合成了L9特異的siRNA和無關(guān)RNA。將siRNA轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，感染RABV，結(jié)果顯示干擾L9能夠顯著增強(qiáng)RABV復(fù)制（4-5倍）;P蛋白表達(dá)量升高了50％以

9、上。以上結(jié)果表明L9對(duì)RABV的復(fù)制具有重要的調(diào)節(jié)作用。
　　5、L9與P蛋白互作干擾了RABV的轉(zhuǎn)錄
　　為了確定L9與RABV互作發(fā)生在病毒生活周期的哪一步，我們檢測(cè)了在L9過表達(dá)時(shí)病毒基因組RNA和mRNA的變化，研究其對(duì)復(fù)制或轉(zhuǎn)錄的影響，并用CHX處理抑制細(xì)胞的翻譯過程。結(jié)果顯示，無論是否用CHX處理細(xì)胞，過表達(dá)L9的情況下，病毒mRNA和基因組RNA的拷貝數(shù)均顯著顯著低于對(duì)照。為了確認(rèn)此結(jié)果的特異性，在同等條件下以