狂犬病病毒P蛋白與宿主RPL9的相互作用及其調控病毒復制的研究.pdf

1、狂犬病是一種人或其他溫血動物的病毒性腦脊髓炎，在家畜和野生動物之間可以自然感染與傳播，感染后一旦出現(xiàn)臨床癥狀，致死率幾乎100％。其病原體是彈狀病毒科狂犬病毒屬的狂犬病毒（Rabies virus，RABV）?？袢《居梢粭l單股負鏈RNA和五種結構蛋白組成，其中磷酸化蛋白P作為一種多功能的非催化活性蛋白，在病毒的轉錄和復制過程中發(fā)揮重要作用。迄今為止，雖然有研究表明狂犬病病毒P蛋白既能與其自身的結構蛋白相互作用，又能與宿主細胞的某些蛋白

2、互作，并參與病毒的生活周期調控，但這方面的研究還相當有限，狂犬病毒的致病機致仍未完全闡明。本研究通過噬菌體展示技術，篩選出與狂犬病毒P蛋白相互作用的宿主核糖體蛋白L9，對其進行了體內、外驗證，并深入研究了其對病毒復制的影響，為進一步闡明狂犬病毒的復制和致病機理奠定基礎。
　　1、RABV-P宿主相互作用蛋白的篩選
　　為了進一步了解狂犬病毒的致病機制，探索P蛋白的生物學功能，首先從狂犬病毒cDNA中擴增并克隆了P基因，利用大

3、腸桿菌表達并純化了P蛋白;進一步通過人腦T7噬菌體展示技術，經(jīng)過五輪篩選，用ELISA，BLAST對比和讀碼框校對等確定了13種與P蛋白相互作用的候選蛋白。
　　2、L9與P蛋白相互作用的驗證
　　為了驗證13種候選蛋白是否與P蛋白直接相互作用，構建了所有候選基因與GST標簽的融合表達質粒，利用原核表達并純化了相關融合蛋白。DOT-pull-down試驗表明L9與RABV-P有明顯的相互作用。通過GST-pull-down試

4、驗證明L9與RABV-P在體外可以直接相互作用。為了排除體外非特異的環(huán)境造成假陽性的結果，在細胞內表達了L9與P蛋白，通過Co-IP試驗進一步證明RABV-P蛋白與L9相互作用。
　　P蛋白與L9在細胞的什么部位相互作用？為了回答這個問題，構建了P融合綠色熒光蛋白GFP和L9融合表達紅色熒光蛋白DsRed的真核表達質粒，共轉HEK-293T細胞，共聚焦熒光顯微鏡觀察結果顯示P蛋白招募大多數(shù)細胞核中的L9蛋白共定位于細胞質中，顯示P

5、與L9在細胞質中有相互作用的可能。為了進一步確證以上結果在自然狀態(tài)下能否發(fā)生，用RABV感染HEK-293T細胞，間接免疫熒光試驗顯示L9與P蛋白仍然共定位于細胞質
　　3、L9與P蛋白相互作用區(qū)域的確定
　　為了確定L9與P蛋白的相互作用位點，利用pull-down實驗進行了一系列研究。首先，將P基因做了P19-297、P52-297、P82-297、P138-297、P172-297、P1-137、P1-180 andP

6、1-218等8個截短，并分別表達、純化相應蛋白，然后與帶有GST標簽的L9蛋白進行GST-pull-down試驗，結果顯示L9與P蛋白的138位至180位氨基酸區(qū)域相互作用。為了確證這一結果，我們構建了缺失該區(qū)域的表達質粒(PΔ138-180)，通過類似的方法證明PΔ138-180蛋白不能與P蛋白結合，進一步驗證了前面的結果。為了確定P蛋白在L9蛋白上的結合位點，根據(jù)L9蛋白結構，我們構建并表達了L91-39、 L91-61、L91-8

7、5、L962-192、 L986-192和L997-192等6個截短突變體。His-pull-down結果表明L9的N端39個氨基酸與P蛋白的相互作用無關。
　　4、L9對RABV生物學功能的研究
　　在細胞水平上過表達L9，通過檢測RABV報告基因的表達水平研究L9對病毒復制的影響，結果表明過表達L9能夠顯著抑制RABV的復制（10-20倍）;western-blot的結果顯示P蛋白的表達量較對照下降了60-70％。為了進

8、一步確證L9抑制RABV的復制是否具有特異性，在過表達L9的條件下測定了VSV的生長曲線，結果顯示VSV的復制與對照沒有顯著差異。以上結果表明L9過表達能特異性地抑制RABV的復制。
　　那么降低L9的表達或敲除L9對RABV的情況會是怎樣呢？為了回答這個問題，合成了L9特異的siRNA和無關RNA。將siRNA轉染HEK-293T細胞，感染RABV，結果顯示干擾L9能夠顯著增強RABV復制（4-5倍）;P蛋白表達量升高了50％以

9、上。以上結果表明L9對RABV的復制具有重要的調節(jié)作用。
　　5、L9與P蛋白互作干擾了RABV的轉錄
　　為了確定L9與RABV互作發(fā)生在病毒生活周期的哪一步，我們檢測了在L9過表達時病毒基因組RNA和mRNA的變化，研究其對復制或轉錄的影響，并用CHX處理抑制細胞的翻譯過程。結果顯示，無論是否用CHX處理細胞，過表達L9的情況下，病毒mRNA和基因組RNA的拷貝數(shù)均顯著顯著低于對照。為了確認此結果的特異性，在同等條件下以