1、狂犬病是重要的人獸共患傳染病，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染，病死率幾乎100％。我國(guó)是狂犬病的多發(fā)區(qū)，近年來(lái)，我國(guó)人狂犬病病例攀居世界第二.家養(yǎng)犬是我國(guó)狂犬病的重要傳播宿主，85％～95％的人狂犬病病例是由犬咬傷所導(dǎo)致，50％～70％的狂犬病病例發(fā)生在農(nóng)村.由于缺少安全有效、價(jià)格低廉、使用方便的動(dòng)物狂犬病疫苗，加之群眾意識(shí)淡薄，導(dǎo)致我國(guó)家犬的免疫覆蓋率極低，野生動(dòng)物更無(wú)狂犬病的計(jì)劃免疫.
犬及犬鼬科野生動(dòng)物是狂犬病病毒侵入人群的
2、主要傳播媒介.因此研制安全有效的動(dòng)物用狂犬病疫苗，是預(yù)防人狂犬病的關(guān)鍵.本實(shí)驗(yàn)室在前期的工作中，建立了以犬2型腺病毒（CAV-2）弱毒株為載體表達(dá)狂犬病病毒弱毒株SRV,糖蛋白的重組CAV-2疫苗(CAV-2-CGS)，免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，該重組疫苗可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的針對(duì)狂犬病病毒的免疫力.但是與完整狂犬病病毒免疫相比，仍然有較大的提高空間.重組疫苗免疫中和抗體產(chǎn)生水平不高，影響因素可能有保護(hù)性抗原基因的選擇、外源基因的表達(dá)水平、體
3、內(nèi)初始腺病毒抗體的干擾等。因此為了進(jìn)一步提高該重組病毒的免疫效價(jià)，本研究作為整個(gè)課題的一部分，選擇狂犬病強(qiáng)毒8202株的糖蛋白膜外區(qū)作為保護(hù)性抗原，以犬2型腺病毒pⅨ為展示表達(dá)載體，構(gòu)建重組犬2型腺病毒.同時(shí)對(duì)8202株糖蛋白膜外區(qū)重組病毒進(jìn)行犬免疫試驗(yàn)，檢測(cè)重組病毒免疫原性，制備狂犬病重組活載體疫苗候選株，為狂犬病重組活載體疫苗研究奠定基礎(chǔ).同時(shí)探討CAV-2pⅨ表達(dá)外源基因的調(diào)控，為完善該病毒載體，提供理論依據(jù).
研究
4、首先在前期獲得的CAV-2感染性全基因組質(zhì)粒pPolyⅡ-CAV-2的基礎(chǔ)上，對(duì)其pⅨ進(jìn)行改造，構(gòu)建了改進(jìn)的CAV-2載體pPolyⅡ-CAV-2-pⅨ-RVG;擴(kuò)大了該載體插入外源基因的容量，完善了CAV-2載體展示研究.然后對(duì)CAV-2pⅨ的羧基末端插入帶有pEGFP-C1polyA的狂犬病病毒8202株糖蛋白膜外區(qū)基因，轉(zhuǎn)染犬腎細(xì)胞系（MDCK），成功獲得了重組病毒CAV-2-pⅨ-RVG。
對(duì)重組病毒CAV-2-p
5、Ⅸ-RVG進(jìn)行了生物學(xué)特性及pⅨ表達(dá)調(diào)控研究。通過(guò)電鏡觀察、細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)測(cè)定、血凝和血凝抑制試驗(yàn)，檢測(cè)病毒的形態(tài)、反應(yīng)原性、生長(zhǎng)特性。通過(guò)PCR、RT-PCR、Westernblot方法對(duì)重組病毒的遺傳穩(wěn)定性和糖蛋白膜外區(qū)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，探討CAV-2pⅨ的外源基因的插其pⅨ表達(dá)調(diào)控的影響.同時(shí)為比較兩株重組病毒的免疫原性之間的差別，對(duì)該重組病毒與前期實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的CAV-2-CGS，進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)研究.結(jié)果
6、顯示，該株重組病毒具有典型的腺病毒形態(tài)結(jié)構(gòu);相同TCID50的重組病毒和疫苗株病毒都能凝集人的紅細(xì)胞，血凝效價(jià)沒(méi)有差別;相同TCID50重組病毒和疫苗株病毒接種MDCK細(xì)胞，病毒增殖特性與疫苗株病毒沒(méi)有差異;重組病毒在體外連續(xù)傳代，性質(zhì)穩(wěn)定，沒(méi)有出現(xiàn)外源基因的缺失和重排;重組病毒感染細(xì)胞后能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄和表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白，具有良好的反應(yīng)原性;pⅨ對(duì)外源基因的表達(dá)量無(wú)影響.
對(duì)表達(dá)狂犬病強(qiáng)毒株8202株糖蛋白膜外區(qū)的重組病
7、毒CAV-2-pⅨ-RVG，通過(guò)口服和肌肉注射兩種免疫途徑對(duì)犬進(jìn)行免疫試驗(yàn)。免疫時(shí)每條犬口服2mL(108TCID50/0.1mL)病毒，免疫前及免疫后每周采血.經(jīng)Western-blot分析抗體組成;HI檢測(cè)腺病毒抗體血凝抑制效價(jià);熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)測(cè)定抗體中和效價(jià)。結(jié)果顯示，重組病毒在犬體內(nèi)同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生了針對(duì)狂犬病病毒和腺病毒的兩種特異性抗體.HI試驗(yàn)表明，該株重組毒與疫苗株病毒血凝效價(jià)消長(zhǎng)規(guī)律基本一致.犬首次免疫后產(chǎn)
8、生的抗狂犬病病毒中和抗體效價(jià)為2.47IU±0.35IU，抗體的消長(zhǎng)規(guī)律相同。重組病毒CAV-2-pⅨ-RVG可以在犬體內(nèi)產(chǎn)生具有保護(hù)水平的中和抗體（0.5個(gè)國(guó)際單位以上）。
綜上所述，本研究成功構(gòu)建了可以表達(dá)8202株糖蛋白膜外區(qū)的CAV-2pⅨ展示載體pPolyⅡ-CAV-2-pⅨ-RVG;構(gòu)建了表達(dá)狂犬病病毒強(qiáng)毒株8202株糖蛋白膜外區(qū)的重組犬2型腺病毒CAV-2-pⅨ-RVG.證明CAV-2pⅨ對(duì)病毒的生物學(xué)特性無(wú)