丙肝病毒核心基因靶向性M1GS核酶的優(yōu)化及其活性研究.pdf

1、自1989年美國(guó)加州的Chiron 公司首先成功地從受感染的黑猩猩血液標(biāo)本中克隆了丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）的cDNA 以來(lái),對(duì)其關(guān)注和研究不斷加強(qiáng)和深入。
　　 HCV 感染不僅是造成慢性肝病的主要原因,同時(shí)也是部分國(guó)家和地區(qū)肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC）的主要病因。目前全球HCV 感染者約有1.7億,每年新增感染者達(dá)300萬(wàn)～400萬(wàn)。HCV 感染的慢性率高達(dá)

2、70％以上,至今尚無(wú)有確切保護(hù)作用的疫苗問(wèn)世,國(guó)際上公認(rèn)的治療方法a 干擾素聯(lián)合利巴韋林持續(xù)應(yīng)答率低下、副作用大且受HCV基因型限制，故迫切需要發(fā)展更有效的療法控制HCV的感染和傳播。
　　 大腸桿菌來(lái)源Rnase P是催化切割ptRNA 5＇端成熟的天然核酶，該酶的催化核心為一個(gè)377 nt的RNA 亞單位（M1RNA），能在具備高鹽離子和適當(dāng)Mg2＋的體外緩沖環(huán)境中對(duì)RNA 底物進(jìn)行位點(diǎn)特異的切割。M1RNA 主要識(shí)別底物的

3、二級(jí)結(jié)構(gòu)，其最小的底物結(jié)構(gòu)必須含有5'單鏈區(qū)和tRNA 氨基酸接受臂的雙鏈莖-環(huán)結(jié)構(gòu)?；诖?，對(duì)于已知序列的靶基因mRNA，均可通過(guò)設(shè)計(jì)一小段引導(dǎo)序列（Guide Sequence，GS）與其互補(bǔ)結(jié)合，結(jié)合后的mRNA/GS 復(fù)合物類似于M1RNA 底物的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可被M1RNA 識(shí)別并特異切割，由此發(fā)展出的新型靶向核酶——即M1GS 核酶。
　　 本文選擇HCV基因組中序列相對(duì)保守、且在病毒復(fù)制過(guò)程中起關(guān)鍵作用的核心基因（co

4、re gene，C）作為靶基因，對(duì)針對(duì)該基因mRNA的靶向性核酶M1GS-HCV/C167通過(guò)切割位點(diǎn)篩選、添加橋序列（Bridge Sequence）等手段進(jìn)行優(yōu)化，以提高其切割活性。
　　 通過(guò)胞外切割試驗(yàn)對(duì)M1GS 核酶的靶向切割活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的核酶M1GS-HCV/C52，M1GS-HCV/C141，其體外切割活性得到提高。初步探索了影響人工核酶M1GS 體外切割效果的因素，發(fā)現(xiàn)M1GS 核酶對(duì)底物RN

5、A片段的體外切割受底物RNA 高級(jí)結(jié)構(gòu)及底物與核酶的反應(yīng)比例的影響。進(jìn)一步的胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建M1GS 核酶真核表達(dá)載體(pc-M1GS52、pc-M1GS141），并與HCV 核心基因真核表達(dá)載體(pc-HCV/core)共轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞，以檢測(cè)M1GS 核酶能否在胞內(nèi)抑制靶基因的表達(dá)。通過(guò)RT-PCR 半定量和Western Blot，結(jié)果表明，優(yōu)化后的M1GS 核酶在胞內(nèi)可使靶基因mRNA的水平降低，同時(shí)能明顯降低HCV核心蛋白的