新型M細(xì)胞靶向性疫苗預(yù)防病毒性心肌炎的作用研究.pdf

1、柯薩奇B3型病毒（coxsackievirus B3 type, CVB3）是病毒性心肌炎（VMC）最常見的病原體，它屬于細(xì)小RNA病毒科腸道病毒屬，是CVB6個(gè)血清型中致病性最強(qiáng)的一型，其感染與急、慢性心肌炎和擴(kuò)張性心臟病關(guān)系緊密。目前對(duì)CVB3的結(jié)構(gòu)和致病機(jī)理有所了解，但臨床上尚無有效的治療和預(yù)防措施，因此新型、高效的疫苗對(duì)于預(yù)防病毒性心肌炎顯得尤為必要。
　　我們前期工作制備了旨在誘導(dǎo)特異性黏膜免疫的新型病毒性心肌炎DNA疫

2、苗chitosan-pVP1（簡(jiǎn)稱chi-pVP1）。該疫苗由編碼CVB3結(jié)構(gòu)蛋白VP1的質(zhì)粒DNA和作為黏膜遞送系統(tǒng)的天然生物多糖chitosan兩部分組成，通過滴鼻免疫可保護(hù)33%的小鼠免于致死性病毒攻擊。為了進(jìn)一步增強(qiáng)該疫苗的黏膜免疫應(yīng)答，提高免疫保護(hù)力，我們擬在原有疫苗系統(tǒng)中引入靶向M細(xì)胞的多肽CPE30，期望設(shè)計(jì)一種新型的黏膜遞送系統(tǒng)，通過全面增強(qiáng)全身及黏膜免疫應(yīng)答，以達(dá)到更好預(yù)防病毒性心肌炎的效果。共獲得如下結(jié)果:
　

3、　一、chi-CPE30-DNA遞送系統(tǒng)的構(gòu)建及生物學(xué)活性研究
　　化學(xué)偶聯(lián)法制備chi-CPE30后，通過共凝聚法形成chi-CPE30-pVP1復(fù)合物顆粒，然后檢測(cè)納米粒的生物學(xué)特性，我們發(fā)現(xiàn)：
　　1）經(jīng)過EDC/NHS化學(xué)偶聯(lián)試劑的偶聯(lián)作用，接近70%的CPE30與chi偶聯(lián)。
　　2）chi-CPE30包裹DNA的效率接近100%，并且chi-CPE30能在一定程度上保護(hù)DNA免遭DNA酶的降解。
　　

4、3）將一定濃度的pVP1溶液，在pH5.5和高速振蕩下，逐滴加入配好的0.02%的chi-CPE30溶液，可形成chi-CPE30-pVP1復(fù)合物顆粒，掃描電鏡證實(shí)復(fù)合物為均一的球形顆粒，大小在200-400nm，帶正電荷。
　　二、滴鼻免疫誘生的CVB3特異性免疫應(yīng)答及免疫保護(hù)
　　以 chi-CPE30-pVP1、chi-pVP1、chi-CPE30-pcDNA3.1和 chi-pcDNA3.1四種疫苗分別于0、2、4、

5、6周滴鼻免疫BALB/c小鼠，每次每種質(zhì)粒50μg，共4次。檢測(cè)特異性抗體水平及細(xì)胞免疫應(yīng)答，我們發(fā)現(xiàn)：
　　1）chi-CPE30-pVP1疫苗滴鼻免疫后，誘生了高水平的血清IgG和黏膜IgA抗體。
　　2）chi-CPE30-pVP1滴鼻免疫促進(jìn)了CVB3特異性血清IgG和糞便IgA抗體親和力成熟。
　　3）特異性淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，chi-CPE30-pVP1有效誘生了脾臟和MLN部位的CVB3特異性淋巴細(xì)胞增

6、殖反應(yīng)。
　　4）特異性CTL活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與chi-pVP1相比，chi-CPE30-pVP1滴鼻免疫能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的脾臟和MLN部位特異性CTL的產(chǎn)生。
　　5）ELISPOT結(jié)果顯示，與chi-pVP1單獨(dú)免疫組相比，chi-CPE30-pVP1滴鼻免疫可有效增加脾臟及MLNIFN-γ分泌細(xì)胞的數(shù)量，提示chi-CPE30-pVP1促進(jìn)了小鼠抗病毒能力。
　　接著，按照我們上述同樣的方法滴鼻免疫小鼠，觀察免疫保護(hù)作

7、用，獲得如下結(jié)果：
　　1）3LD50CVB3腹腔感染4天后，以體重減輕率衡量小鼠發(fā)病情況，對(duì)照組小鼠在感染后第4天體重明顯下降，而chi-CPE30-pVP1免疫組小鼠感染后體重改變輕微，僅為4.76%。
　　2）以血清學(xué)指標(biāo)來衡量小鼠心肌損傷程度：chi-CPE30-pVP1滴鼻免疫組小鼠的CK和CK-MB顯著低于chi-pVP1組和對(duì)照組小鼠。
　　3）取感染后7天的小鼠心臟，觀察心肌病理學(xué)改變，結(jié)果顯示：chi

8、-CPE30-pVP1組心肌病理改變最輕，近似于正常，提示chi-CPE30-pVP1滴鼻免疫疫苗提供了最有力的免疫保護(hù)。
　　4）胰腺組織病理觀察結(jié)果與心肌組織類似，對(duì)照組小鼠胰腺腺泡被大量破壞，幾乎未見正常組織結(jié)構(gòu)；chi-pVP1免疫組腺泡組織破壞較輕，但有大團(tuán)炎性浸潤(rùn)，范圍較廣；chi-CPE30-pVP1組小鼠腺泡結(jié)構(gòu)完整，未見組織壞死，僅可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　5）以 TCID50測(cè)定感染小鼠組織病毒載量，結(jié)

9、果顯示，chi-CPE30-pVP1組與chi-pVP1組相比，心臟和胰腺組織病毒載量明顯較低。提示chi-CPE30-pVP1滴鼻免疫組誘生的全身及黏膜局部免疫應(yīng)答能夠有效清除病毒。
　　6）以5LD50CVB3病毒攻擊后，觀察28天小鼠存活情況，發(fā)現(xiàn)chi-CPE30-pVP1滴鼻免疫組42%小鼠實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)期存活；與對(duì)照組相比有明顯差異。
　　三、評(píng)估25μg口服免疫誘生的CVB3特異性免疫應(yīng)答及免疫保護(hù)
　　以 c

10、hi-CPE30-pVP1、chi-pVP1、chi-CPE30-pcDNA3.1和chi-pcDNA3.1四種疫苗分別于0、2、4、6周口服免疫BALB/c小鼠，每次每種質(zhì)粒25μg，共4次。檢測(cè)CVB3特異性免疫應(yīng)答及免疫保護(hù)，評(píng)估口服免疫效果。我們發(fā)現(xiàn)：
　　1）chi-CPE30-pVP125μg口服免疫后，誘生了較高水平的血清IgG和黏膜IgA抗體。
　　2）特異性淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，chi-CPE30-pVP1

11、顯著誘生了脾臟及 MLN部位的CVB3特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。
　　3）ELISPOT結(jié)果顯示，與chi-pVP1單獨(dú)免疫組相比，chi-CPE30-pVP1口服免疫可顯著增加脾臟及MLN IFN-γ分泌細(xì)胞的數(shù)量，有助于抗病毒。
　　4）取感染后7天的小鼠心臟和胰腺，觀察病理學(xué)改變，結(jié)果顯示：chi-CPE30-pVP1口服免疫組心臟和胰腺近似于正常，提示口服免疫該疫苗提供了高效的免疫保護(hù)。
　　5）以免疫組化檢測(cè)感

12、染后口服免疫小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)病毒，結(jié)果顯示， chi-CPE30-pVP1免疫小鼠心肌細(xì)胞正常清晰，未見有病毒顆粒染色。提示chi-CPE30-pVP1疫苗可誘生更有效的抗病毒免疫應(yīng)答，從而在CVB3攻擊后4天，心肌內(nèi)較好地清除了感染病毒。
　　四、chi-CPE30-pVP1增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答的機(jī)制探討
　　從體外和體內(nèi)兩個(gè)方面證明新型黏膜疫苗的靶向遞送作用對(duì)其增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)具有重要意義。獲得如下結(jié)果：
　　

13、1) FITC-chi-CPE30-DNA結(jié)合轉(zhuǎn)染claudin4的293T細(xì)胞的能力更強(qiáng)。
　　2)體內(nèi)小腸M細(xì)胞靶向?qū)嶒?yàn)證明 chi-CPE30-DNA M細(xì)胞攝取量明顯多于chi-DNA。
　　本研究首先成功構(gòu)建了新型M細(xì)胞靶向性黏膜遞送系統(tǒng)，然后將chi-CPE30-pVP1免疫小鼠，詳細(xì)觀察了滴鼻免疫誘生的CVB3特異性全身和黏膜免疫應(yīng)答及免疫保護(hù)，并且簡(jiǎn)單評(píng)估及預(yù)測(cè)了口服chi-CPE30-pVP1疫苗能夠誘生更