大黃素治療小鼠病毒性心肌炎的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　1.觀察大黃素在病毒性心肌炎(VMC)小鼠中的療效;
　　2.觀察大黃素調(diào)控TLR介導(dǎo)的心肌病理?yè)p傷的炎癥應(yīng)答作用;
　　3.建立CVB3誘導(dǎo)的小鼠病毒性心肌炎模型，探討大黃素調(diào)控病毒感染引起心肌炎癥免疫應(yīng)答的相關(guān)分子機(jī)制;
　　4.優(yōu)化VMC的治療策略，開拓大黃素的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　研究方法:
　　選擇90只雄性4-6周齡的BALB/c小鼠，體重均在14-16g之間，按照隨機(jī)數(shù)字表

2、法隨機(jī)將小鼠分為三組，分別是A組:對(duì)照組，B組:模型組，C組:大黃素組，每組30只小鼠。A組:小鼠給予腹腔注射0.1ml不含病毒液的培養(yǎng)液。B組:小鼠腹腔注射0.1ml內(nèi)含1×102TCID50柯薩奇病毒B3的Eagle's液建立VMC模型，C組:建立VMC模型基礎(chǔ)上，大黃素灌胃給藥30mg/kg/d，1次/d，連續(xù)給藥14d;A、B組小鼠給予喂飼等量的蒸餾水，觀察小鼠的生存情況，記錄實(shí)驗(yàn)期間小鼠死亡數(shù)目。于實(shí)驗(yàn)開始后第7d每組處死5只

3、小鼠，取出心臟測(cè)定病毒滴度，將心臟剪碎后研磨，離心取上清液，稀釋成不同的濃度，取各種濃度（10-110-2，10-3，10-4，10-5，10-6）的稀釋液0.2ml，加入96孔板（Hela細(xì)胞），設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，觀察細(xì)胞情況，病變孔:病變細(xì)胞＞50％，依據(jù)Reed-Muench法測(cè)定，采用lgTCID50。熒光定量PCR測(cè)定CVB3mRNA拷貝數(shù):提取心肌組織中病毒的總RNA，紫外分光光度法測(cè)定D260/D280比值(1.8-2.0)，

4、擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，重復(fù)測(cè)定3次，以相對(duì)表達(dá)量表示。然后分別在第7天、第14天每組抽取小鼠8只，處死解剖，取出心臟，經(jīng)固定、水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、石蠟切片制作、封片、HE染色等步驟制作小鼠心肌病理切片。HE染色觀察心肌病理形態(tài)學(xué)變化，并進(jìn)行病理積分的計(jì)算。方法如下:做好的切片每一張均隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，在高倍鏡視野下觀察并計(jì)算視野內(nèi)壞死區(qū)域的面積以及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)面積所占整個(gè)視野面積的比值。0分:無(wú)病變;1分:病

5、變面積＜25％;2分:病變面積25％-50％;3分:病變面積51％-75％;4分:病變面積＞75％。
　　RT-PCR測(cè)定心肌組織TLR4mRNA，首先把心肌組織總的RNA提取出來(lái)，然后再將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-PCR依據(jù)Trizol法操作，定量采用紫外分光光度計(jì)，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，重復(fù)測(cè)定3次，以相對(duì)表達(dá)量表示:基因灰度值與B-actin灰度值比值。Western-blot法測(cè)定心肌炎癥因子、TLR4-

6、NF-kB、P38MAPK表達(dá)，ELISA檢測(cè)血清水平炎癥因子變化。
　　并進(jìn)行乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)，取1天齡的新生乳鼠60只，均采取牽拉脊柱法處死，然后固定在泡沫板上;沿小鼠的左肋下緣逐漸將胸腔剪切開，充分暴露胸腔并找到心臟，用剪刀剪斷大血管和周圍組織，再用鑷子將心臟輕輕取出，把心室部分的心臟組織完全剪碎，用不含血清的培養(yǎng)液洗1～2遍之后，轉(zhuǎn)移入50ml離心管中;經(jīng)胰酶反復(fù)消化6次，取沉淀物重懸并在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后再進(jìn)

7、行傳代與凍存。經(jīng)原代培養(yǎng)新生乳鼠的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為了4組，分別是A組:對(duì)照組，B組:模型組，C組:大黃素組，D組:LPS+大黃素組。其中，A組不給予病毒液。B組:應(yīng)用CVB3感染心肌細(xì)胞8h。C組:用大黃素100ug/ml預(yù)處理心肌細(xì)胞2h，再應(yīng)用CVB3感染心肌細(xì)胞8h。D組:預(yù)先LPS激活心肌細(xì)胞病毒8h，再用大黃素100ug/ml進(jìn)行阻斷2h。檢測(cè)TLR4、NF-kB及其下游關(guān)鍵因子IkBα及p65的蛋白水平變化。通過(guò)Wester

8、n-blot法測(cè)定炎癥因子、TLR4-NF-kB與相關(guān)分子如p-IkBα、p-p65的表達(dá)及TNF-α、IL-1、IL-6、MCP-1等因子的濃度。
　　研究結(jié)果:
　　1.與對(duì)照組比較，模型組心肌病理積分、心肌組織P38MAPK、TLR4mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05);與模型組比較，大黃素組死亡率、病毒滴度、CVB3mRNA拷貝數(shù)、心肌病理積分顯著降低(P＜0.05)，心肌組織P38MAPK、TLR4mRNA表達(dá)明顯

9、下調(diào)(P＜0.05)。
　　2.TNF-α、IL-6、IL-1β及MCP-1的血清濃度在模型組較對(duì)照組顯著升高，兩者有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);而使用大黃素干預(yù)后，大黃素組小鼠血清濃度較模型組有明顯的降低，并且比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　3.TNF-α、IL-6、IL-1β及MCP-1的蛋白水平在模型組較對(duì)照組顯著升高，兩者有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);而使用大黃素干預(yù)后，大黃素組小鼠的蛋白水平較模

10、型組有明顯的降低，并且比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　4.心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，使用病毒感染細(xì)胞組別中TLR4、NF-kB蛋白表達(dá)顯著升高，IkBα及p65的磷酸化水平也有明顯上調(diào);而使用大黃素預(yù)處理組別中，這些蛋白水平有了明顯的下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.使用TLR4激動(dòng)劑LPS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)在LPS+Emodin組，其炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β及MCP-1的濃度水平與模型組無(wú)

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而與大黃素組比較，則有明顯的升高。
　　研究結(jié)論:
　　1.在VMC的發(fā)病進(jìn)程中，TLR4-NF-κB和TLR4-P38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑起關(guān)鍵性作用。
　　2.在VMC的發(fā)病進(jìn)程中，炎癥反應(yīng)始終存在，諸多免疫炎癥因子如TNF-α、IL-1、IL-6、MCP-1等發(fā)揮了重要作用。
　　3.大黃素有治療小鼠病毒性心肌炎的作用，其分子機(jī)制:(1)大黃素通過(guò)下調(diào)TLR4、P38MAPK水平