新型M細(xì)胞靶向性DNA疫苗的制備及其對CVB3病毒性心肌炎的免疫保護(hù)作用.pdf

1、黏膜免疫系統(tǒng)作為人體抵抗外來病原體的第一道防線，發(fā)揮重要的抗病毒作用。通過在腸黏膜表面誘生特異性的黏膜免疫應(yīng)答可以有效抵抗病毒和細(xì)菌等的攻擊，從而控制感染程度。因此黏膜疫苗的開發(fā)受到了研究者的親睞，但是由于黏膜疫苗誘生免疫應(yīng)答能力的不足和誘導(dǎo)免疫耐受的傾向，目前只有少量的黏膜疫苗研制成功并投入使用。因此在黏膜疫苗的的研制過程中如何提高其免疫應(yīng)答能力成為一個急需解決的問題。
　　M細(xì)胞是位于派氏結(jié)中的一種特化的上皮細(xì)胞，數(shù)量較少[1

2、]。其基底部是不連續(xù)的，能夠允許淋巴細(xì)胞的自由通過，有利于其抗原轉(zhuǎn)運速率的提高。與其鄰近腸上皮細(xì)胞相比，M細(xì)胞頂膜面缺乏較厚的糖萼結(jié)構(gòu)和粘液，這使得M細(xì)胞頂膜的關(guān)鍵受體易于被細(xì)菌或病毒識別并結(jié)合，促進(jìn)其對外來病原體的識別。因此，我們利用M細(xì)胞這種特殊的結(jié)構(gòu)設(shè)計了一種新型的M細(xì)胞靶向性疫苗。
　　GP2是一類糖蛋白，作為抗原識別受體特異性的表達(dá)于小腸上皮M細(xì)胞頂膜面，是第一個被發(fā)現(xiàn)在人和小鼠M細(xì)胞表面均能表達(dá)的分子，具有更好的特異性

3、。已發(fā)現(xiàn)大腸桿菌Ⅰ型菌毛蛋白FimH能夠與GP2特異性結(jié)合。因此，我們在實驗室原有疫苗CS-pVP1的基礎(chǔ)上引入FimH蛋白，設(shè)計一種新型的黏膜遞送系統(tǒng)，從而評估其的誘生CVB3特異性的黏膜免疫應(yīng)答及其對CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎的保護(hù)作用。目前我們已有的結(jié)果:
　　一、CS-FimH-DNA遞送系統(tǒng)的構(gòu)建及其特性研究
　　M細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)CS-FimH-pVP1的制備及其理化性質(zhì)的研究:通過EDC活化FimH蛋白的羧基，

4、使其能夠與CS的氨基相互作用進(jìn)而使兩者偶聯(lián)到一起，制備成CS-FimH靶向遞送系統(tǒng)。采用復(fù)合物共沉淀法將已制備好的FimH-CS遞送系統(tǒng)與pcDNA3.1-vp1質(zhì)?；旌现瞥蓪嶒炈璧募{米粒。結(jié)果顯示:
　　(1)我們的偶聯(lián)效率大約為60％，即接近60％的FimH蛋白與CS發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。
　　(2)在CS-FimH靶向系統(tǒng)的保護(hù)下，DNA可以避免被DNaseI酶解，很好的保護(hù)了DNA使其能夠順利到達(dá)靶向部位。通過粒徑檢測發(fā)現(xiàn)

5、該納米粒的粒徑大約在200-400nm之間。
　　二、口服免疫誘生的CVB3特異性免疫應(yīng)答及免疫保護(hù)
　　靶向性疫苗CS-FimH-pVP1口服免疫小鼠后誘導(dǎo)的CVB3特異性黏膜免疫應(yīng)答:我們的實驗組為CS-FimH-pVP1，對照組為CS-pVP1，空載對照組CS-FimH-pcDNA3.0和CS-pcDNA3.0。隔周免疫BALB/c小鼠，共免疫四次，每次免疫的質(zhì)粒總量為25ug。末次免疫后兩周CVB3攻毒，檢測該疫苗誘

6、生的CVB3特異性的黏膜免疫應(yīng)答。結(jié)果顯示:
　　(1)靶向性疫苗CS-FimH-pVP1經(jīng)口服后可以誘導(dǎo)高水平的黏膜IgA抗體，但是沒有顯著誘生高水平的血清IgG水平。
　　(2)靶向性疫苗CS-FimH-pVP1經(jīng)口服后可以促進(jìn)IgA抗體親和力成熟，但是IgG的抗體親和成熟沒有顯著差異。
　　(3)CVB3特異性的T細(xì)胞殺傷活性(CTL)檢測發(fā)現(xiàn)與對照組CS-pVP1免疫的小鼠發(fā)現(xiàn)，經(jīng)實驗組CS-FimH-pVP1

7、免疫的小鼠的MLN部位能有誘生較強的CTL，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(4)CVB3特異性淋巴細(xì)胞增殖實驗顯示發(fā)現(xiàn)與對照組CS-pVP1免疫的小鼠發(fā)現(xiàn)，經(jīng)實驗組CS-FimH-pVP1免疫的小鼠在MLN部位誘生了有效的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。
　　(5)IFN-γ+ ELISPOT實驗檢測小鼠脾臟和MLN部位T細(xì)胞分泌IFN-γ+能力，發(fā)現(xiàn)經(jīng)實驗組CS-FimH-pVP1免疫的小鼠MLN部位T細(xì)胞分泌IFN-γ+的能力顯著高于對照組C

8、S-pVP1，但是在脾臟部位T細(xì)胞分泌IFN-γ+的能力與對照組相比并沒有顯著增強。
　　評估靶向性疫苗CS-FimH-pVP1對感染CVB3的小鼠的免疫保護(hù)作用。結(jié)果顯示:
　　(1)末次免疫兩周后的小鼠經(jīng)CVB3腹腔感染后開始稱量小鼠體重，觀察感染病毒小鼠體重變化情況，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)靶向性疫苗CS-FimH-pVP1免疫過的小鼠感染CVB3后體重變化較少，體毛順滑，飲食正常。而對照組CS-pVP1小鼠的體重下降較為明顯，且小

9、鼠狀態(tài)較差，活動減少。
　　(2)CK、CK-MB可以作為診斷心肌炎的一個重要指標(biāo)。CK、CK-MB的檢測結(jié)果顯示CS-FimH-pVP1免疫組的CK及CK-MB的指標(biāo)明顯低于CS-pVP1免疫組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。說明經(jīng)CS-FimH-pVP1免疫過后的小鼠的心肌炎的癥狀較輕。
　　(3)由CVB3感染而引起的急性心肌炎以心肌細(xì)胞的壞死和炎性細(xì)胞的浸潤為特征。心肌病理切片結(jié)果顯示空載組小鼠的心肌細(xì)胞損壞嚴(yán)重并

10、夾帶炎癥，炎性淋巴細(xì)胞成團分布;而CS-pVP1組小鼠的心肌壞死有所減輕，只有少量的炎性淋巴細(xì)胞聚集在一起成團分布和壞死灶的數(shù)量也有所減少;CS-FimH-pVP1組小鼠的心肌細(xì)胞損壞最少，炎性細(xì)胞成團現(xiàn)象也明顯減少，無明顯異常，正常心肌細(xì)胞病理切片狀態(tài)相似。
　　(4)CS-FimH-pVP1免疫組小鼠感染病毒后心臟病毒滴度的測定結(jié)果顯示:FimH-CS-pVP1免疫組小鼠心肌細(xì)胞的TCID50明顯低于對照組CS-pVP1。說明

11、FimH-CS-pVP1免疫組誘生的黏膜免疫應(yīng)答能夠有效清楚小鼠感染的CVB3病毒。
　　(5)為進(jìn)一步評價各組疫苗誘生的免疫保護(hù)效應(yīng)，取末次免疫后兩周的小鼠進(jìn)行致死劑量攻毒結(jié)果發(fā)現(xiàn)空載組在第七天左右全部死亡，對照組CS-pVP1大約有40％的生存率，而CS-FimH-pVP1免疫組則有大約接近70％的生存率。
　　(6)小動物超聲成像系統(tǒng)可以監(jiān)測小鼠心臟的收縮和舒張指標(biāo)，從而評價小鼠的心功能水平FimH-CS-pVP1免疫

12、組小鼠左心室收縮壓以及射血分?jǐn)?shù)的數(shù)值趨于正常組小鼠，相比于對照組CS-pVP1有顯著提高，說明FimH-CS-pVP1可以明顯改善感染CVB3病毒小鼠的心功能。
　　三、CS-FimH-pVP1增強黏膜免疫應(yīng)答的機制
　　靶向性疫苗CS-FimH-pVP1口服免疫誘生的CVB3特異性的黏膜免疫應(yīng)答的機制化探討
　　(1)體外成功構(gòu)建M細(xì)胞模型。UEA-1的表達(dá)證明我們的M-cell體外模型構(gòu)建成功。
　　(2)

13、M細(xì)胞對CS-FimH-pVP1納米粒的轉(zhuǎn)運效率的檢測顯示M細(xì)胞對CS-FimH-pVP1納米粒的轉(zhuǎn)運效率隨著時間的增加而逐漸提高，并且顯著高于對照組CS-pVP1。
　　(3)免疫熒光的方法分析該納米粒的CS-FimH-pVP1是否是通過GP2的介導(dǎo)而被M-cell所攝取，我們可以發(fā)現(xiàn)，具有靶向性能力的CS-FimH-pVP1納米粒與GP2具有較多的共定位，而對照組CS-pVP1則幾乎沒有與GP2的共定位。
　　綜上所述，