肝癌靶向性復(fù)制缺陷型腺病毒的構(gòu)建及其作用研究.pdf

1、肝癌是嚴(yán)重危害我國人群健康的主要腫瘤之一，因其傳統(tǒng)手術(shù)、放療、化療效果均不甚理想，基因治療策略被認(rèn)為具有良好的應(yīng)用前景。而基因治療需要面對的一個首要問題即為其作用的靶向性或特異性。目前，研究者普遍采用的方法即利用組織特異性調(diào)控元件特異啟動治療基因在相應(yīng)組織中的表達(dá)。甲胎蛋白在大多數(shù)原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者血清中均明顯升高，甲胎蛋白啟動子已廣泛應(yīng)用于肝癌的靶向性基因治療中。研究已證實(shí)，人原發(fā)性肝癌中存在著高頻率的p16基因失活，其中p16的5’

2、CpG島甲基化及純合性缺失發(fā)生頻繁。因此，將外源性p16基因?qū)敫伟┘?xì)胞中，有可能恢復(fù)p16對細(xì)胞增殖的抑制作用、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 本研究利用AdEasyXLAdenoviralVectorSystem，將外源性p16基因分別置于人α-甲胎蛋白核心啟動子AF0.3、CMV啟動子及HREAF雜合啟動子下游，插入穿梭載體質(zhì)粒中，再將線性化的穿梭質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BJ5183-AD-1細(xì)菌，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-

3、1在細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行同源重組產(chǎn)生出重組腺病毒載體質(zhì)粒，經(jīng)PacⅠ酶切暴露左右兩端ITR后，分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，構(gòu)建、包裝出攜帶外源性p16基因的重組復(fù)制缺陷型腺病毒Ad-CMV-p16、Ad-AFP-p16、Ad-HREAF-p16和AdTrack-CMV-p16。 選擇純化的重組腺病毒Ad-AFP-p16作為目標(biāo)病毒，感染人肝癌細(xì)胞系HepG2和Bel-7402，經(jīng)MTT比色實(shí)驗(yàn)、WesternBlotting檢測，證實(shí)體外感

4、染Ad-AFP-p16的HepG2和Bel-7402可高效表達(dá)P16蛋白，細(xì)胞生長受到明顯抑制，而人正常肝細(xì)胞LO2及非肝癌細(xì)胞在感染Ad-AFP-p16后生長未受明顯抑制。進(jìn)一步經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析、DNA片斷化分析及Hoechst33258核染色，顯示Ad-AFP-p16可特異誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，而感染Ad-AFP-p16的人正常肝細(xì)胞LO2未見明顯凋亡。經(jīng)體內(nèi)初步試驗(yàn)亦可看出，Ad-AFP-p16對小鼠肝癌細(xì)胞株H22的體內(nèi)成瘤具有