新一代腫瘤條件復(fù)制腺病毒構(gòu)建及其喉癌生物治療研究.pdf

1、凋亡抑制因子（survivin）屬凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族成員，由142個氨基酸組成，通過抑制Caspase3、Caspase7活性抑制細胞凋亡，并通過與微管、紡錘體作用調(diào)節(jié)細胞分裂。hTERT基因是編碼人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶基因，調(diào)節(jié)端粒酶活性的關(guān)鍵基因。Survivin和hTERT基因選擇性地在多種惡性腫瘤細胞中表達而在正常成熟組織中不表達。我們在前期實驗中成功克隆了survi

2、vin及hTERT啟動子基因，經(jīng)pGL3-Basic熒光素酶報告基因表達載體證實，該兩個啟動子能高特異性地在腫瘤細胞中調(diào)控下游基因表達，其活性甚至高于CMV啟動子。survivin及hTERT基因啟動子高活性及惡性腫瘤表達譜廣泛性，使其更適合于構(gòu)建腫瘤特異性復(fù)制腺病毒（Tumour-Selectively Replicating Oncolytic Adenovirus，T-SROAd）。因此，我們擬通過雙啟動子（survivin和hT

3、ERT啟動子）分別調(diào)控腺病毒復(fù)制必需基因E1A及E1B的表達，并攜帶蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(Protein Transduction Domain,PTD)和野生型p53融合基因，構(gòu)建新一代的T-SROAd。
　　目的：
　　通過構(gòu)建和包裝雙啟動子（survivin和hTERT啟動子）調(diào)控的腺病毒復(fù)制必需基因E1A及E1B的表達，并攜帶蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)和野生型p53融合基因的重組腺病毒，為喉癌乃至所有survivin及hTERT高表

4、達的惡性腫瘤探索出一種新的、療效更高、毒副作用更低并適用于轉(zhuǎn)移瘤的生物治療新方法
　　方法：
　　(1)PCR方法分別擴增腫瘤特異性survivin及hTERT啟動子，并克隆入腺病毒載體pXC1的兩個復(fù)制必需基因E1A和E1B序列上游啟動子區(qū)，hTERT啟動子同時調(diào)控PTD-P53及IRES連接的E1B基因，即HP-PTDP53-IRES融合基因，構(gòu)建出雙腫瘤特異性啟動子調(diào)控的條件復(fù)制腺病毒載體pXC1-SP-HP53；

5、r>　　(2)重組腺病毒載體與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGE3在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染293E細胞進行同源重組，空斑技術(shù)獲取病毒，并進行病毒擴增、純化、滴度測定及遺傳穩(wěn)定性鑒定，將病毒命名為Ad-SP-HP53；
　　(3)重組腺病毒Ad-SP-HP53感染人喉癌細胞Hep-2，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察細胞病變效應(yīng)，MTT檢測方法觀察其對喉癌細胞Hep-2的特異性溶瘤作用，并以正常人的血管內(nèi)皮細胞ECV304作為對照。流式細胞術(shù)及AO/EB染色檢

6、測重組腺病毒感染后Hep-2細胞凋亡；
　　(4)裸鼠體內(nèi)注射Hep-2細胞成瘤后，瘤體注射Ad-SP-HP53，觀察其對腫瘤的生長抑制作用。
　　結(jié)果：
　　(1)限制性酶切及測序方法鑒定結(jié)果證實，成功構(gòu)建了雙腫瘤特異性啟動子調(diào)控的復(fù)制腺病毒載體pXC1-SP-HP53；
　　(2)同源重組獲得高滴度重組腺病毒，滴度為3.9×1010TCID50/ml。重組腺病毒遺傳穩(wěn)定性較好，經(jīng)RT-PCR分析重組病毒感染的

7、Hep-2細胞顯示，目的基因在Hep-2細胞中呈陽性表達；
　　(3)MTT結(jié)果顯示，Ad-SP-HP53可有效抑制喉癌細胞增殖而對正常細胞無增殖抑制作用（p<0.05）；活細胞計數(shù)及細胞形態(tài)觀察結(jié)果顯示，重組腺病毒在喉癌細胞中選擇性復(fù)制并發(fā)揮溶細胞作用；流式細胞術(shù)及凋亡染色顯示，Ad-SP-HP53可有效促進Hep-2的凋亡；
　　(4)裸鼠體內(nèi)抑瘤實驗顯示，構(gòu)建的重組腺病毒Ad-SP-HP53可有效抑制腫瘤生長，延長裸鼠