不依賴CAR的腎癌組織特異性復(fù)制缺陷型重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、目的：構(gòu)建攜帶腎癌特異性啟動(dòng)子碳酸酐酶IX（Carbonic Anhydrase IX。CAIX)和人源化綠色熒光蛋白（humanized renilla reniformis Green Fluorescent Protein。hrGFP-1)報(bào)告基因的不依賴CAR的復(fù)制缺陷型5型重組腺病毒Ad5/f11-CAIX-E1A-hrGFP-1，建立檢測(cè)腎癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells。CTCs)

2、的新方法，為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　方法：分別雙酶切pShuttle-CMV-hrGFP-1、pShuttle-CAIX-E1A獲得hrGFP-1目的基因片段和載體基因片段，T4 DNA連接酶過(guò)夜連接，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CAIX-E1A-hrGFP-1，搖菌并提取質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，鑒定證實(shí)構(gòu)建正確的質(zhì)粒經(jīng)PmeI酶切線性化，與骨架質(zhì)粒AdEasy-1/f11p依次轉(zhuǎn)化入感受態(tài) BJ5183細(xì)菌，通過(guò)同源重

3、組技術(shù)構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd5/f11-CAIX-E1A-hrGFP-1。將經(jīng)PCR、酶切鑒定證實(shí)構(gòu)建正確的重組腺病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5a細(xì)菌擴(kuò)增、保存。陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)PacI酶切后，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得重組腺病毒Ad5/f11-CAIX-E1A-hrGFP-1，經(jīng)4輪擴(kuò)增后純化病毒，檢測(cè)其滴度。
　　結(jié)果：經(jīng)PCR、酶切鑒定，證實(shí)重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CAIX-E1A-hrGFP-1、重組腺病毒質(zhì)粒pAd5/f