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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:
全球約1.5億人感染HCV,并且部分患者會(huì)發(fā)展成慢性感染進(jìn)而引發(fā)肝硬化及肝癌等疾病,嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。目前,長(zhǎng)效干擾素聯(lián)合利巴韋林是治療慢性丙型肝炎的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。但是,由于IFN-α受體在體內(nèi)廣泛分布而引發(fā)一系列不良反應(yīng),加之耐藥性的存在,嚴(yán)重阻礙了它的臨床應(yīng)用。新的IFN家族——Ⅲ型干擾素(IFN-λ),具有有限的受體分布且相同的抗病毒作用,成為替代IFN-α用于臨床治療HCV慢性感染者的新希望。
干擾素
2、刺激基因是IFN信號(hào)傳導(dǎo)通路中發(fā)揮抗病毒作用的終極武器,但是同時(shí)也是一把雙刃劍。ISG中存在一類(lèi)負(fù)調(diào)控因子(包括USP18和SOCS1),他們阻斷干擾素信號(hào)通路的傳導(dǎo)形成負(fù)反饋調(diào)節(jié),這也是造成HCV對(duì)IFN治療耐受的原因之一。USP18(Ubiquitin specific protease18)是一種泛素特異性蛋白,它可以通過(guò)與IFNAR2受體結(jié)合阻斷Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的傳導(dǎo),而對(duì)于Ⅲ型干擾素信號(hào)通路的影響還是個(gè)未知數(shù)。同時(shí),細(xì)胞因子
3、信號(hào)傳導(dǎo)抑制分子1(Suppressor of cytokinesignaling1,SOCS1)作為干擾素內(nèi)源性抑制物,可以與Tyk2相互作用從而阻斷干擾素信號(hào)通路,抑制干擾素抗病毒活性導(dǎo)致HCV持續(xù)感染。而SOCS1在HCV的入胞和分泌過(guò)程中的作用還鮮有報(bào)道。
多項(xiàng)研究表明(包括本課題組前期研究),肝組織內(nèi)ISG差異表達(dá)與治療療效密切相關(guān)。此外,外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear ce
4、lls,PBMCs)有可能替代肝穿樣本用于療效預(yù)測(cè)的檢測(cè)??紤]到目前干擾素治療HCV感染療效不理想及廣泛的不良反應(yīng),揭示HCV耐藥的分子機(jī)制和建立高效的療效預(yù)測(cè)手段是HCV科研領(lǐng)域兩個(gè)亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。本研究立足于探討負(fù)調(diào)控因子(USP18和SOCS1)在HCV耐受干擾素中的作用機(jī)制。
目的:
1、研究IFN-α和IFN-λ激活Jak/STAT及ISG表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)曲線的差異;
2、驗(yàn)證高表達(dá)USP18/
5、SOCS1對(duì)IFN-α和IFN-λ信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控和抗HCV活性的影響及在HCV病毒生活史中的作用(入胞、復(fù)制和分泌);
3、探討慢性丙肝病人PBMC中相關(guān)基因的表達(dá)水平差異與治療療效的相關(guān)性。
方法:
1、將pCR3.1/SOCS1和pCR3.1/USP18真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Huh7.5.1細(xì)胞中,通過(guò)Realtime PCR和Western blot檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)情況從而優(yōu)化最適表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑量,
6、轉(zhuǎn)染試劑使用量及IFN濃度。給予IFN-α和IFN-λ刺激后,不同時(shí)間點(diǎn)取樣,Realtime PCR測(cè)定ISG時(shí)間效應(yīng)曲線以及高表達(dá)USP18/SOCS1對(duì)于時(shí)間效應(yīng)曲線的影響。
2、將pCR3.1/USP18和pCR3.1/SOCS1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入復(fù)制子細(xì)胞Con1b、JFH1-2a及HCVcc體外培養(yǎng)系統(tǒng)中,通過(guò)雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng)、Realtime PCR和Western blot檢測(cè)高表達(dá)USP18/SOCS1對(duì)IFN
7、信號(hào)通路中P-STAT1磷酸化水平、ISRE活性及ISG表達(dá)水平的影響及HCV RNA復(fù)制水平的影響。在HCVcc體外培養(yǎng)系統(tǒng)中高表達(dá)USP18/SOCS1,收集上清液,通過(guò)測(cè)定TCID50明確高表達(dá)USP18或SOCS1對(duì)HCV分泌的影響;提取胞內(nèi)RNA,逆轉(zhuǎn)錄后通過(guò)Realtime PCR檢測(cè)USP18或SOCS1高表達(dá)對(duì)HCV受體的調(diào)控及HCV RNA復(fù)制水平的影響從而確定其對(duì)HCV入胞的影響。
3、從48個(gè)治療后的HC
8、V慢性患者中提取PBMC,體外培養(yǎng)8h并同時(shí)給予IFN-α刺激,將未經(jīng)IFN-α刺激的體外培養(yǎng)PBMC作為陰性對(duì)照,通過(guò)Realtime PCR檢測(cè)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化并確定其與治療療效的相關(guān)性。
結(jié)果:
1、使用最適轉(zhuǎn)染體系及最佳IFN工作濃度,我們確認(rèn)兩種干擾素(IFN-α/IFN-λ)誘導(dǎo)ISGs(ISG15/MxA)的時(shí)間效應(yīng)曲線具有明顯差異:IFN-α誘導(dǎo)下ISG表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)曲線峰值出現(xiàn)快且持續(xù)時(shí)間短,
9、而IFN-λ誘導(dǎo)下ISG表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)曲線峰值出現(xiàn)慢且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng);而由這兩種干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的負(fù)調(diào)控因子(USP18/SOCS1)表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)曲線正好與之相反。提示干擾素信號(hào)傳導(dǎo)通路中兩個(gè)主要的負(fù)調(diào)控因子SOCS1及USP18是導(dǎo)致Ⅰ型和Ⅲ型干擾素激活Jak/STAT刺激ISG表達(dá)的時(shí)間動(dòng)力學(xué)差異的主要原因。
2、高表達(dá)USP18/SOCS1在HCV復(fù)制子細(xì)胞(Con1b和JFH1-2a)中,可以通過(guò)下調(diào)P-STAT磷酸化水平
10、、減弱ISRE活性及降低ISG表達(dá)水平從而全面阻斷Ⅰ型干擾素和Ⅲ型干擾素信號(hào)通路。此外,在HCVcc體外培養(yǎng)系統(tǒng)中也表明,由它們所介導(dǎo)的這種對(duì)干擾素信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制作用顯著地促進(jìn)了HCV的復(fù)制水平,并且高表達(dá)USP18顯著上調(diào)了HCV受體LDLR和SR-BI的轉(zhuǎn)錄水平從而促進(jìn)了HCV病毒的入胞,而高表達(dá)SOCS1雖然顯著上調(diào)了HCV受體LDLR的轉(zhuǎn)錄水平但對(duì) HCV病毒的入胞無(wú)影響。此外這兩種負(fù)調(diào)控因子對(duì)于HCV分泌均無(wú)影響。
11、 3、本實(shí)驗(yàn)對(duì)PBMC中部分基因的表達(dá)變化與干擾素治療HCV療效相關(guān)性進(jìn)行了初步探討,我們明確了MxA、SOCS1、IFNAR1及IFNλR在干擾素治療無(wú)應(yīng)答組的本底水平高表達(dá),而USP18和ISG15在治療有應(yīng)答與無(wú)應(yīng)答不同組中本底水平的表達(dá)無(wú)差異。
結(jié)論:
1、證明負(fù)調(diào)控因子(USP18/SOCS1)的表達(dá)差異是造成IFN-α和IFN-λ激活干擾素信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)抗病毒ISG(ISG15/MxA)時(shí)間效應(yīng)曲線差
12、異的主要原因,可能也是造成IFN耐受的原因之一。
2、高表達(dá)USP18/SOCS1可以阻斷Ⅰ型干擾素和Ⅲ型干擾素信號(hào)通路而顯著促進(jìn)HCV病毒復(fù)制,其中,高表達(dá)USP18可以上調(diào)HCV入胞受體水平而有利于病毒入胞。促進(jìn)HCV入胞、刺激HCV RNA復(fù)制及全面抑制干擾素信號(hào)傳導(dǎo)通路也許是HCV耐受干擾素導(dǎo)致治療失敗的重要原因。
3、明確HCV慢性患者PBMC中MxA、SOCS1、IFNAR1及IFNλR在本底水平的高表達(dá)
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