USP18在IFN-α抗乙肝病毒機(jī)制中的作用及調(diào)控研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是一個(gè)世界性的問(wèn)題。盡管有效的乙肝疫苗已在臨床上廣泛運(yùn)用。慢性HBV感染能夠?qū)е赂斡不透渭?xì)胞肝癌等危害嚴(yán)重的終末期肝病。雖然近年來(lái)有多種抗HBV藥物不斷涌現(xiàn)，但α干擾素（IFN-α）是目前治療慢性HBV感染的首選藥物之一，其具有療程固定、停藥后復(fù)發(fā)率低、部分患者可出現(xiàn)HBsAg陰轉(zhuǎn)而獲得“徹底治愈”等優(yōu)點(diǎn)。長(zhǎng)效聚乙二醇干擾素還具有用藥間隔時(shí)間長(zhǎng)、副作用相對(duì)較少等優(yōu)點(diǎn)。但目前

2、仍面臨著價(jià)格昂貴和相當(dāng)一部分患者的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率低等問(wèn)題。IFN-α應(yīng)答率低的具體分子機(jī)制仍不十分明確，有待進(jìn)一步研究。在前期的工作當(dāng)中我們發(fā)現(xiàn)慢乙肝患者IFN-α治療前應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組肝細(xì)胞中存在大量差異表達(dá)的基因。其中干擾素刺激基因USP18和ISG15位于同一信號(hào)通路，USP18在治療前在無(wú)應(yīng)答組中高表達(dá)，提示其可能與IFN-α抗HBV的活性相關(guān)，HBV可能調(diào)控宿主細(xì)胞中USP18的表達(dá)，進(jìn)而改變IFN-α的抗病毒活性。

3、　　目的：
　　1.HBV感染肝癌細(xì)胞對(duì)USP18表達(dá)的影響。
　　2.構(gòu)建shRNA-USP18慢病毒載體，研究其對(duì)Hepg2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制能力的影響。
　　3.研究shRNA-USP18慢病毒載體在不同濃度IFN-α作用下對(duì)HBV復(fù)制能力的影響。
　　4.研究shRNA-USP18慢病毒載體是否是通過(guò)調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路調(diào)節(jié)IFN-α的抗HBV作用。
　　5.利用生物信息學(xué)初步分析H

4、epg2.2.15-shRNA-USP18細(xì)胞中的差異表達(dá)基因及相關(guān)信號(hào)通路。
　　方法：
　　1.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同肝癌細(xì)胞系中USP18 mRNA的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染HBV表達(dá)質(zhì)粒，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot及雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HBV感染對(duì)USP18 mRNA、蛋白及啟動(dòng)子活性的影響。
　　2.構(gòu)建shRNA-USP18慢病毒載體，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選出干擾效率最佳的慢病毒載體，

5、并篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot驗(yàn)證Hepg2.2.15-shRNA-USP18細(xì)胞中對(duì)USP18的干擾效率。
　　3.利用定量PCR檢測(cè)干擾USP18表達(dá)對(duì)Hepg2.2.15細(xì)胞中HBV DNA、pgRNA和total RNA復(fù)制的影響。利用ELISA檢測(cè)干擾USP18對(duì)Hepg2.2.15細(xì)胞中HBsAg和HBeAg分泌的影響。利用熒光定量PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)USP18對(duì)Hepg2.2.15細(xì)

6、胞中HBV DNA、pgRNA和total RNA復(fù)制的影響。利用ELISA檢測(cè)過(guò)表達(dá)USP18對(duì)Hepg2.2.15細(xì)胞中HBsAg和HBeAg分泌的影響。
　　4.利用熒光定量PCR檢測(cè)干擾USP18表達(dá)后IFN-α對(duì)Hepg2.2.15細(xì)胞中HBV復(fù)制的影響。利用ELISA檢測(cè)干擾USP18表達(dá)后IFN-α對(duì)Hepg2.2.15細(xì)胞中HBsAg和HBeAg分泌的影響。利用Western blot檢測(cè)干擾USP18表達(dá)后IFN

7、-α對(duì)Hepg2.2.15細(xì)胞中HBcAg生成的影響。
　　5.利用熒光定量PCR檢測(cè)干擾USP18表達(dá)后IFN-α對(duì)Hepg2.2.15細(xì)胞中JAK/STAT下游的干擾素刺激基因ISG15、MxA和IFIT1 mRNA的影響。利用Western blot檢測(cè)干擾USP18表達(dá)后IFN-α對(duì)Hepg2.2.15細(xì)胞中JAK/STAT下游的干擾素刺激基因ISG15、MxA和IFIT1蛋白的影響。利用Western blot檢測(cè)干擾U

8、SP18表達(dá)后IFN-α對(duì)Hepg2.2.15細(xì)胞中JAK/STAT信號(hào)通路中磷酸化STAT1及STAT1總蛋白表達(dá)的影響。利用Western blot檢測(cè)干擾USP18表達(dá)后IFN-α處理不同時(shí)間點(diǎn)及不同加藥方式對(duì) Hepg2.2.15細(xì)胞中 JAK/STAT信號(hào)通路中磷酸化STAT1及STAT1總蛋白表達(dá)的影響。
　　6.利用基因芯片檢測(cè)干擾USP18表達(dá)后Hepg2.2.15細(xì)胞中差異表達(dá)的基因，并利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)軟件對(duì)

9、差異表達(dá)的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.Hepg2.2.15細(xì)胞中USP18的表達(dá)水平較其他肝癌細(xì)胞中的表達(dá)高，HBV明顯促進(jìn)宿主細(xì)胞中USP18的表達(dá)，選擇HepG2和Hepg2.2.15細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。HBV感染能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞中USP18 mRNA和蛋白的表達(dá)，并能增強(qiáng)其啟動(dòng)子活性。
　　2.針對(duì)USP18篩選出干擾效率最佳的慢病毒載體并構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株Hepg2.2.15-shRNA-US

10、P18。Hepg2.2.15-shRNA-USP18細(xì)胞中USP18 mRNA和蛋白的表達(dá)受到明顯抑制。
　　3.干擾USP18表達(dá)后Hepg2.2.15細(xì)胞中HBV DNA、pgRNA和total RNA的復(fù)制受到明顯抑制。Hepg2.2.15細(xì)胞中HBsAg和HBeAg的分泌受到明顯抑制。過(guò)表達(dá)USP18后Hepg2.2.15細(xì)胞中HBV DNA、pgRNA和 total RNA的復(fù)制明顯增強(qiáng)。Hepg2.2.15細(xì)胞中 HB

11、sAg和HBeAg的分泌明顯增強(qiáng)。
　　4.干擾USP18表達(dá)后IFN-α對(duì)Hepg2.2.15細(xì)胞中HBV DNA、pgRNA和 total RNA復(fù)制的抑制作用明顯增強(qiáng)。干擾USP18表達(dá)后IFN-α對(duì)Hepg2.2.15細(xì)胞中HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用明顯增強(qiáng)。干擾USP18表達(dá)后IFN-α對(duì)Hepg2.2.15細(xì)胞中HBcAg生成的抑制作用明顯增強(qiáng)，且在IFN-α不同濃度組中均有明顯的抑制作用。
　　5.干

12、擾USP18表達(dá)后IFN-α對(duì)Hepg2.2.15細(xì)胞中JAK/STAT下游的干擾素刺激基因ISG15、MxA和IFIT1 mRNA和蛋白的誘導(dǎo)作用明顯增強(qiáng)。干擾USP18表達(dá)后IFN-α對(duì)Hepg2.2.15細(xì)胞中JAK/STAT信號(hào)通路中磷酸化STAT1表達(dá)的誘導(dǎo)作用明顯增強(qiáng)。干擾USP18表達(dá)后IFN-α處理不同時(shí)間點(diǎn)，Hepg2.2.15細(xì)胞中JAK/STAT信號(hào)通路中磷酸化 STAT1表達(dá)明顯增強(qiáng)。不同加藥方式下干擾USP18

13、表達(dá)后Hepg2.2.15細(xì)胞中JAK/STAT信號(hào)通路中磷酸化STAT1表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　6.初步篩選出干擾USP18后Hepg2.2.15細(xì)胞中差異表達(dá)的基因及相關(guān)的生物學(xué)功能和信號(hào)通路。
　　結(jié)論：
　　1.肝癌細(xì)胞HepG2中HBV感染可促進(jìn)USP18的表達(dá)并增強(qiáng)USP18啟動(dòng)子的活性。
　　2.干擾USP18表達(dá)后Hepg2.2.15細(xì)胞中HBV的復(fù)制和分泌受到明顯抑制。
　　3.干擾USP18