氧化還原調(diào)控在皮質(zhì)醇調(diào)節(jié)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)葡萄糖代謝的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　肝臟是維持體內(nèi)血糖穩(wěn)態(tài)的核心器官，正常時(shí)負(fù)責(zé)循環(huán)中80％葡萄糖的釋放。其中50％源自肝糖原分解，剩下的由肝糖異生。正常情況下，腎臟儲(chǔ)存的少量糖原通過糖異生發(fā)揮作用?？崭箺l件下，糖異生作用增加，其負(fù)責(zé)循環(huán)中葡萄糖的比例隨著空腹時(shí)間的延長(zhǎng)和體內(nèi)糖原儲(chǔ)備的下降而升高，空腹24小時(shí)約70％，而空腹48小時(shí)可達(dá)90％以上。因此，糖原分解和糖異生，特別是糖異生是保證空腹時(shí)血糖穩(wěn)定和腦、腎等重要器官能量供應(yīng)的先決條件。而這兩條途徑的

2、最終末反應(yīng)，即從葡萄糖6磷酸到葡萄糖的過程，是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)由葡萄糖6磷酸酶催化的。
　　機(jī)體血糖的穩(wěn)態(tài)離不開神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)。作為主要的升糖激素，糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GC)在應(yīng)激、糖尿病、胰島素抵抗、肥胖等代謝性異常中有重要作用。循環(huán)中糖皮質(zhì)激素主要來源包括:1.腎上腺皮質(zhì):受下丘腦-垂體-腎上腺軸調(diào)控;2.局部器官:肝臟、脂肪組織等，其中肝臟約占1/3,肝外組織約2/3（主要為脂肪細(xì)胞）。其生成主要在內(nèi)質(zhì)

3、網(wǎng)中，11β-羥基類固醇脫氫酶1（11β-hydroxysteroid dehydrogenase type1,11β-HSD1）催化無活性的皮質(zhì)酮轉(zhuǎn)化成有活性的皮質(zhì)醇。
　　在細(xì)胞水平，糖皮質(zhì)激素通過結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體發(fā)揮生理作用，糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)屬于核受體超家族，包括正常的GRα和變異片段GRβ兩類亞型。GR位于細(xì)胞漿，與熱休克蛋白(heat shock protein90

4、，HSP90)形成二聚體。糖皮質(zhì)激素通過擴(kuò)散作用或其他轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞漿與受體結(jié)合后，受體的原有構(gòu)象發(fā)生變化，HSP90從受體解離出去，而與糖皮質(zhì)激素結(jié)合的受體則轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，通過兩種機(jī)制引起靶基因轉(zhuǎn)錄的改變:1.以二聚體形式，通過結(jié)合位于受調(diào)控基因啟動(dòng)子內(nèi)的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(glucocorticoid responseelement，GRE)，進(jìn)一步改變靶基因轉(zhuǎn)錄;2.以激素-受體復(fù)合物形式，通過調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步影響靶

5、基因的轉(zhuǎn)錄。然而，有研究發(fā)現(xiàn)GC存在調(diào)節(jié)細(xì)胞生物活性的非基因調(diào)控途徑，并且外周組織生成的皮質(zhì)醇可局部放大GR激活后的效應(yīng)。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)氧化還原狀態(tài)對(duì)其功能有重要影響。正常情況下，高濃度的NADPH/NADP+比率使11β-HSD1具有還原酶活性，以利于活化糖皮質(zhì)激素。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)NADPH生成主要由H6PDH催化G6P代謝生成。由于G6P是G6Pase催化生成葡萄糖的底物，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的酶學(xué)反應(yīng)將葡萄糖代謝和糖皮質(zhì)激素代謝緊緊

6、相連。
　　方法:
　　本研究在既往研究發(fā)現(xiàn)及目前研究現(xiàn)狀基礎(chǔ)上，推測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)存在G6P池供H6PD和G6Pase利用，且氧化還原狀態(tài)的改變可導(dǎo)致G6P的重新分配利用，參與葡萄糖代謝。因此，本實(shí)驗(yàn)主要圍繞皮質(zhì)醇、肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原狀態(tài)及葡萄糖代謝的關(guān)系，利用酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理，分別從以下方面進(jìn)行研究:(1)應(yīng)用不同G6Pase抑制劑及不同濃度G6P，觀察葡萄糖和二氧化碳的變化，探究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)存在G6P池;并通過酶動(dòng)力學(xué)計(jì)算

7、，明確H6PDH和G6Pase是否平均分配利用G6P;(2)在不同G6P濃度下，觀察不同濃度皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮對(duì)葡萄糖和二氧化碳生成的影響;(3)應(yīng)用皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮及11β-HSD1抑制劑，觀察NADPH的變化。由于目前對(duì)NADP是否能通過完整內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜仍有爭(zhēng)議，本研究還觀察不同時(shí)間下NADPH的變化。通過上述系統(tǒng)研究，明確皮質(zhì)醇通過11β-HSD1改變腔內(nèi)NADPH/NADP對(duì)葡萄糖合成的刺激作用，為進(jìn)一步闡明神經(jīng)內(nèi)分泌對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)提供實(shí)

8、驗(yàn)依據(jù)。
　　結(jié)果:
　　1.G6P通過G6PT自細(xì)胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)后，形成一個(gè)G6P池，作為G6Pase和H6PDH的底物參與相應(yīng)反應(yīng)。但通過酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程計(jì)算發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)酶利用G6P的比例并不均等。
　　2.盡管既往有研究認(rèn)為完整ER膜對(duì)NADP沒有通透性，但本研究通過長(zhǎng)時(shí)間孵育（30分鐘）發(fā)現(xiàn)NADP可以緩慢透過完整ER膜。
　　3.皮質(zhì)醇可以通過11β-HSD1改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的NADPH/NADP+